卵母细胞低浓度保护剂下超快速玻璃化保存研究

卵母细胞的玻璃化保存在辅助生殖、胚胎工程及种质库等领域发挥着重要作用。由于目前可用的冷却方法所能够达到的最高冷却速率约为10000K/min，要实现玻璃化必须采用4-7M高浓度的低温保护剂，这对卵母细胞的毒性和渗透损伤很严重，大大降低了卵母细胞玻璃化后的存活率和发育潜能，限制了该技术的进一步发展。.本项目从理论分析和实验相结合的角度出发，以目前效率最高的Cryotop冷冻体系为基础进行改进，研究在低浓度低温保护剂条件下实现卵母细胞超高速玻璃化保存的方法。首先建立Cryotop冷冻体系的传热模型，分析影响冷冻速率的因素；通过改变载体材料和厚度以及采用浆态氮为冷源，建立新的冷冻体系；测试新的冷冻体系的热性能，并找出在其能获得的最快冷却速率下保护剂玻璃化所需的浓度阀值；最后将新的冷冻体系和低浓度保护剂用于牛卵母细胞玻璃化保存，通过其存活率、分裂率以及胚泡率评价该方法的有效性。

本项目主要研究在低浓度低温保护剂条件下实现卵母细胞超高速玻璃化保存的方法，各项研究内容基本按照项目计划进行。具体情况如下：对卵母细胞玻璃化冷冻的几种方法（弹射法、OPS法、QMC法、Cryotop法）进行传热分析，得出Cryotop法在传热特点以及降温速率上优于其它三种方法。对Cryotop冷冻过程进行数值模拟，分析载板厚度、冷冻保护液体积、冷源温度以及对流换热系数等因素对冷冻速率的影响规律。搭建快速降温速率的测量系统，测量了不同厚度的商品化Cryotop和自制铜片Cryotop，在液氮和浆态氮中的降温速率，得出60μm厚的铜片Cryotop降温速率最高。将实际测量与模拟计算的降温速率相对比，得出Cryotop冷冻过程的模拟计算中所需对流换热系数范围约为 6000 W/(m2•K)<h<8000 W/(m2•K) 。采用差示扫描量热仪（DSC）测量冷冻保护剂的结晶放热量，计算出玻璃化转变所需冷冻速率阈值范围。选择优化后的Cryotop方案进行了猪MII期卵母细胞的玻璃化冷冻保存，结果表明Cryotop载板厚度的变化对卵母细胞复温后的存活率没有显著性影响。. 此研究结果与项目预期有一定的差别，我们推测可能原因是目前的降温速率已经能够实现冷冻过程的玻璃化，而复温过程的反玻璃化才是制约存活率和发育潜能的瓶颈。因此，在原项目计划的基础上，增加了纳米颗粒用于卵母细胞低温保存的可行性和保护机理的研究，旨在利用纳米颗粒强化传热、促进成核的性质改善溶液的再结晶性质。分析了纳米颗粒在低温保护剂中的分散性，开展了纳米颗粒对猪GV期、MⅡ期卵母细胞低温保存影响的实验研究，发现添加0.05%羟基磷灰石纳米颗粒能显著提高卵母细胞冷冻复温后的存活率和发育潜能，低温显微镜观察显示纳米颗粒减少了复温过程中的再结晶，这可能是其提高细胞存活率的主要机理。. 到目前为止，本项目已发表（含已录用）研究论文11篇，其中2篇国际期刊，6篇中文核心期刊，3篇会议论文；申请专利3项，授权2项；培养硕士研究生3名，博士研究生1名；参加国内外学术会议四次，与爱尔兰国立都柏林大学、上海第六人民医院和上海市农业科学院建立良好的合作关系。