IolS介导麝香草酚清除金黄色葡萄球菌耐药留存细胞的作用机制

Staphylococcus aureus can form persisters with multidrug resistance, which often cause chronic recurrent infection and disease. The persister formation is considered dependent on TA system and SOS reaction. We found thymol could eradicate persisters in S. aureus by leading to staphylococci membrane perforation. By bioinformatics analysis, we speculate that an ion channel protein IolS on the surface of cell membrane mediate this process. In this project, we will target IolS to study the role of it in the process of apoptosis caused by thymol through analyzing the characteristics and drug susceptibility of the IolS deletion and overexpression mutants. In addition, we will analyze the eradicating effect of thymol on different persisters produced by different ways including by over expression of relA and recA or induced by antibiotics, which either initiate the TA system or the SOS reaction. At last, we will study the relationship between membrane perforations caused by thymol and their dependence on IolS or CidA, and define the following downstream events and death pathway caused by thymol. The insights into mechanism underlying the prevalence against the multidrug tolerance of persisters by thymol will contribute to the application of thymol and the development of new bactericide in the control of infection by S. aureus.

金黄色葡萄球菌能形成多药耐受留存细胞，导致慢性感染和疾病反复发作。留存细胞的形成与毒素-抗毒素系统（TA）和应急修复系统（SOS）有关。申请者发现麝香草酚处理金黄色葡萄球菌可导致膜穿孔并清除留存细胞，生物信息学推测膜表面离子通道蛋白（IolS）介导了这一过程。本项目拟以IolS为研究对象，通过构建IolS缺失和超表达突变体，研究其在麝香草酚诱发细胞死亡过程中的作用；进而采用超表达relA、recA或抗生素诱导等方式启动菌体的TA和SOS系统诱导留存细胞形成，研究麝香草酚对不同留存细胞的清除效应；最后监测留存细胞经麝香草酚处理后造成的膜穿孔对IolS和CidA的依赖情况，并通过对死亡下游事件的监测来判断麝香草酚诱发的死亡类型，了解这种死亡诱导方式是如何克服留存细胞的多药抗性的。本研究可为麝香草酚控制金黄色葡萄球菌污染和新型杀菌剂的开发提供理论参考。

金黄色葡萄球菌能形成耐药留存细胞，导致慢性感染和疾病反复发作，危害人类健康。为了阻止耐药金黄色葡萄球菌的感染，我们需要更为有效的杀菌剂。我们发现麝香草酚可有效抑制并杀死耐药金黄色葡萄球菌及其留存细胞。为了给新型杀菌剂的研发及麝香草酚在耐药菌控制领域的应用提供理论依据，我们研究了麝香草酚对金黄色葡萄球菌的杀菌机制，明确了其作用靶标。通过生物信息学预测，我们发现金黄色葡萄球菌的醛酮还原酶IolS可作为麝香草酚的作用靶标介导其杀菌过程。等温滴定的实验结果表明麝香草酚直接与IoS蛋白发生结合反应，突变IolS蛋白的Y30和L33氨基酸残基将导致麝香草酚不能与其发生结合反应，证明这两个氨基酸残基是麝香草酚与IolS蛋白发生结合反应的关键靶位点。与野生型菌株相比，缺失了IolS蛋白的金黄色葡萄球菌突变株及IolS蛋白的Y30和L33氨基酸残基发生突变的突变株对麝香草酚的耐药性均显著增强，表明麝香草酚与IolS蛋白Y30和L33残基的结合介导了其杀菌活性。生化分析结果显示麝香草酚与IolS蛋白的结合能够显著增强IolS蛋白的醛酮还原酶活性。用200μg/mL的麝香草酚处理金黄色葡萄球菌后可使菌体内的NADPH含量显著降低，在该浓度处理下麝香草酚可完全抑制菌体的生长。而在该处理条件下同时添加外源NADPH可缓解麝香草酚对金黄色葡萄球菌的抑制作用，这表明NADPH的缺失是麝香草酚处理菌体后导致菌体死亡的主要原因之一。我们通过遗传学和生物化学的方法研究证明麝香草酚可直接结合细菌的膜内蛋白IolS蛋白提高其醛酮还原酶活性，导致菌体内NADPH的缺失，影响膜脂合成改变细胞膜的通透性，进而导致菌体死亡。麝香草酚作为一种萜类抗菌化合物可用于治疗创伤感染。本研究表明IolS蛋白是麝香草酚的直接作用靶标，介导了麝香草酚处理下的菌体细胞早期死亡。本研究首次明确了麝香草酚的杀菌作用靶标，本研究的发现可促进其他以增强菌体醛酮还原酶活性或降低菌体NADPH含量为目的的抗菌化合物的筛选与应用。