弓形虫效应分子ROP18抑制Wnt/β-catenin通路干扰神经干细胞分化的机制研究

Toxoplasma gondii (T.gondii) is a major cause of congenital brain disease. Encephalopathy caused by T. gondii significantly threatens the newborn infants. Neural stem cells (NSCs) play a crucial role in the development of central nervous system and neuropathogensis. Our previous studies indicated that Toxoplasmic excreted/secreted proteins inhibited the differetiation of NSCs, among them rhoptry18(ROP 18) greatly interfered with Wnt/β-catenin pathway and downregulated expressions of β-catenin and Ngn1 and Nng2 that are closely associated with subsequent NSC differentiation, indicating an adverse affect of ROP18 on NSC proliferation and differentiation. Using the primary NSCs of mouse/C17.2 cell line, and ROP18 deletion mutant of T.gondii, here we will have a deep insight into the degredation of ROP18-phosphorylated β-catenin, the synergic effect of GSK3β by rROP18 transfection, intracellular co-localization, siRNA knock-down and knock-in. The aim of the present study is to uncover the inhibitory mechanism of the effector molecule of ROP18 derived from T. gondii in NSCs differetiation via Wnt/β-catenin signaling pathway in Toxoplasmic encephalopathy, and to pave the way for implementation of control strategy of congenital toxoplasmosis.

弓形虫是一种重要的生物致畸因子，其所致先天性脑病严重损害婴幼儿健康。神经干细胞（NSC）在神经系统发育和病理机制中起关键作用。课题组前期研究显示，弓形虫分泌排泄物可抑制NSC分化，其中棒状体蛋白18（ROP18）能抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而显著降低NSC内β-catenin以及下游参与神经干细胞分化的Ngn1和Nng2表达，提示ROP18可调控Wnt/β-catenin信号途径干扰NSC分化。本研究采用小鼠原代NSC及其细胞系C17.2以及弓形虫ROP18的缺失突变体，以rROP18转染、胞内共定位、siRNA敲低和回补等，观察NSC形态以及分化标志物、ROP18磷酸化并降解β-catenin及与GSK3β的协同作用等，旨在揭示 ROP18对NSC分化与Wnt/β-catenin信号通路的抑制与调控机制。本研究对于揭示弓形虫脑病的发病机制及制定防治策略，具有重要意义。

弓形虫是一种重要的嗜中枢先天性致畸因子。然而，其对神经系统发育的源头——神经干细胞分化的影响及其分子机制所知甚少。Wnt／ β-catenin信号通路是神经干细胞分化过程中的重要信号通路，该信号通路的抑制将会导致严重的中枢神经系统发育畸形。本研究以弓形虫重要的毒力因子ROP18为切入点，研究其对神经干细胞分化的影响及其对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用及机制。研究结果发现，弓形虫ROP18蛋白不仅能够抑制体外培养神经干细胞的分化和增殖，还能促进神经干细胞的分化；在ROP18促进神经干细胞分化的机制研究中发现ROP18可以显著降低Wnt/β-catenin通路中的关键分子β-catenin的表达水平，以及下游靶基因Ngn1和Ngn2的表达，并且可以抑制Wnt信号通路的活性；在进一步的ROP18在神经干细胞内的互作蛋白的筛选过程中我们通过GST Pull-Down初步筛选到12个可疑目标蛋白。目标蛋白的鉴定及其与ROP18相互作用的机制尚在进一步研究中。本课题的研究结果进一步丰富了我们对弓形虫感染致神经损伤机制的认识，为进一步制定有效的防治弓形虫致神经系统损害提供了理论与实验依据。在本课题的资助下共发表与研究内容相关的论文9篇，申请国家发明专利二项，完成了预定成果目标。