脑源性神经营养因子辅助雪旺细胞治疗实验性自身免疫性神经炎的研究

本项目拟采用200μg P257-81多肽诱导实验性自身免疫性神经炎(EAN)大鼠模型，将经过脑源性神经营养因子(BDNF)处理的雪旺细胞(SCs)分别在急性期（致敏后第14天）和慢性期（致敏后第28天）进行移植，比较单独SCs移植和BDNF处理的SCs移植在EAN急性期和慢性期的作用。主要从神经修复和免疫学角度探讨其作用机制，包括检测大鼠T细胞功能，淋巴结细胞和血清中细胞因子类型及含量，周围神经脱髓鞘、轴突崩解的修复情况和炎性细胞浸润类型、数量及凋亡情况，周围神经粘附分子、趋化因子及神经营养因子的表达情况等。在荧光显微镜下观察移植后SCs存活、分化、迁徙情况，考察植入细胞与神经根及周围神经是否整合良好，是否具有正常生理功能，而无成瘤倾向，探讨这是否能成为EAN的一种新型治疗方法，为EAN的治疗开辟新道路，为GBS的细胞移植治疗奠定实验理论基础。

目的 研究脑源性神经营养因子（BDNF）辅助雪旺细胞（SCs）治疗实验性自身免疫性神经炎（EAN）的效果。 .方法 原代培养SCs，加入不同浓度BDNF，通过检测细胞增殖活力和上清液中神经生长因子（NGF）及成纤维细胞生长因子（FGF）水平判断BDNF的最佳刺激浓度。用P2(57-81)多肽和弗氏完全佐剂的混合乳液免疫Lewis大鼠建立EAN模型，在致敏第14天经小脑延髓池注射荧光染料CFSE标记的SCs或经BDNF处理的SCs，致敏第45天作为研究终点。致敏后每日对大鼠进行临床评估；分别于致敏第25、35、45天处死部分大鼠，取其坐骨神经，观察荧光标记细胞的迁移情况，进行HE、Luxol-fast-Green及免疫组化染色，评价炎性细胞浸润及脱髓鞘情况；Real time-PCR法检测坐骨神经CD11a、CCL3、NGF及S-100 mRNA表达情况；致敏第45天处死的大鼠同时取腹股沟淋巴结，测定淋巴细胞培养液上清细胞因子含量。.结果 BDNF终浓度为50ng/mL时SCs的增殖及分泌能力最高。移植的SCs能向脱髓鞘神经组织迁移。SCs+BDNF移植组与EAN模型组比较：致敏第45天瘫痪分值降低；致敏第25及35天炎症细胞浸润、CD4、CD8、CD68、CD54及CD11a阳性细胞数均减少；致敏第35及45天髓鞘脱失程度减轻；各时间点S-100阳性细胞数均增多，而NGF的阳性细胞数均减少；致敏第25天NGF的mRNA表达量明显减低，而S-100的mRNA表达量明显增高；致敏第35天CCL3的mRNA表达量明显减低；致敏第45天CD11a、CCL3及NGF的mRNA表达量明显减低，而S-100的mRNA表达量明显增高，淋巴细胞培养液上清IFN-γ水平明显降低，而IL-10及TGF-β1水平明显增高。SCs移植组与EAN模型组比较各时间点各指标差异均无统计学意义。.结论 BDNF对离体培养的SCs增殖和分泌功能有促进作用，终浓度为50ng/mL时SCs的活力最佳。经小脑延髓池植入的SCs细胞可迁徙到坐骨神经。应用与BDNF共培养的SCs移植治疗EAN有效，提示BDNF可辅助SCs发挥治疗作用。机制可能涉及抑制炎症细胞浸润、减轻髓鞘脱失、促进髓鞘再生、促进周围神经组织表达S-100及降低NGF应激性增高、抑制促炎性因子及促进抑炎性因子释放等通路发挥作用。