青藤碱对LPS诱导ICAM-1高表达的干预机制研究

The bacterial endotoxin diseases are acute onset, rapid progress, serious illness and high mortality rate in veterinary clinic. We screened out significant effect drug sinomenine for antiendotoxin from six alkaloids of traditional Chinese medicine in previous trials. Intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) play important roles in a number of physiological and pathological processes, such as inflammation, fever, coagulation and shock. The endotoxin induces vascular endothelial cells with high expression of ICAM-1 for pathological model of this project. Firstly we want to investigate the expression of ICAM-1 induced by LPS and/or sinomenine from the levels of cell, protein and transcription. Then ICAM-1 signal transduction pathway will be detected by protein content for phosphorylated and total of ERK1/2, p38, SAPK/JNK. The intervention process of sinomenine for antiendotoxin will be analyzed by activity of NF-κB. The specific mechanisms of sinomenine for antiendotoxin will be interpreted by differentially expressed genes from whole-genome microarray. Lastly the pharmacological effect of sinomenine will be proved by a number of indication in target animal pigs. All these research will provide the theoretical basis for prevention and control of bacterial diseases in veterinary clinic, as well as research and development of the Chinese traditional veterinary medicine.

兽医临床上细菌内毒素引起的疾病，起病急速，进展迅速，病情凶险，病死率高，严重制约我国畜牧产业的健康发展。我们前期从六种中药生物碱成分中，筛选出抗内毒素效果显著的药物青藤碱。细胞间黏附分子-1（ICAM-1）在炎症、发热、凝血、休克等内毒素诱发的病理过程中起关键作用。本项目拟以内毒素诱导猪血管内皮细胞高表达ICAM-1为病理模型，首先从细胞分泌、蛋白翻译和转录水平，逐步深入研究青藤碱对ICAM-1不同阶段表达的影响，明确药时关系。其次观察青藤碱对ICAM-1信号传导通路上的关键节点ERK1/2、p38、SAPK/JNK和NF-κB的阻抑作用，解析药物的干预过程。然后采用高通量的全基因组芯片检测技术，通过差异基因表达情况分析青藤碱抗内毒素的具体机制。最后通过靶动物体内试验，进一步细化证实青藤碱的抗内毒素功效，旨在为兽医临床细菌疫病的防控和中兽药制剂的系列研发提供理论依据。

兽医临床上细菌内毒素引起的疾病，起病急速，进展迅速，病情凶险，病死率高，严重制约我国畜牧产业的健康发展。我们前期从六种中药生物碱成分中，筛选出抗内毒素效果显著的药物青藤碱。本项目借助高通量的基因芯片检测等分子生物学手段，通过体内和体外试验两大部分，从整体水平、细胞水平、蛋白水平、转录水平和基因水平五个层次解析了青藤碱阻抑信号传导通路、维持炎症反应平衡和改善毒素病理效应的靶点与机制。体外试验部分，基因芯片正式试验，分空白对照组、毒素对照组、药物对照组、治疗组、预防组、同时作用组六个组别分别处理与采样。结果显示，在43603个猪检测基因/转录本中：LPS组VS.空白组共有1722个差异表达基因，其中上调基因859个，下调基因863个；提示本试验模型建立成功，内毒素对细胞的影响作用广泛，重点突出。治疗组VS. LPS组共有723个差异表达基因，其中上调基因410个，下调基因313个；提示青藤碱作为抗内毒素的治疗药物，对受损细胞有修复与改善作用。预防组VS. LPS组共有1792个差异表达基因，其中上调基因862个，下调基因930个；提示青藤碱作为抗内毒素的预防药物，相比治疗组，药理作用更为全面，涉及多项生理过程与生化反应。同时用药组VS. LPS组共有677个差异表达基因，其中上调基因360个，下调基因317个；相比较治疗组与预防组，同时用药组的差异表达基因数量明显减少许多。猜测青藤碱与LPS可能存在直接的体外理化中和作用或生物拮抗效应。青藤碱组VS.空白组共有1139个差异表达基因，其中上调基因721个，下调基因418个；提示青藤碱具有杀菌抑菌、抗肿消炎、加速愈合等药理作用，并未见明显的毒性与副作用，安全有效。体内试验部分，主要进行了靶动物猪体内试验指标检测及其生物学分析。结果显示，青藤碱能显著降低机体炎症因子ICAM-1和P-selectin的含量增加，有效修复小肠病变，具有明显的量效关系和一定的时效关系，推测原因与青藤碱抑制LPS的受体TLR4和靶标ICAM-1的受体LFA-1高水平表达有关。