青藤碱对乳腺癌MDA-MB-231细胞的作用及机制研究

青藤碱是从青风藤及毛青藤中提取的生物碱单体，通过抑制COX-2的活性使炎症局部PGE2减少，起抗炎和免疫抑制作用。许多肿瘤细胞高表达COX-2，应用青藤碱可以抑制COX-2活性，在肺癌、肝癌等恶性细胞系中显示出抗肿瘤活性，这种活性通过促凋亡来实现，但具体细胞信号通路尚未阐明。另一种COX-2抑制剂塞莱昔布，可通过下调NF-кB信号通路促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡。目前，青藤碱对乳腺癌细胞作用的研究尚未见相关报道。本研究拟采用realtime-PCR、Westernblot等实验方法，在体外及动物模型中观察青藤碱对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响，探索青藤碱诱导其凋亡的机制，并进一步阐明COX-2、MEK/ERK、PI3K/Akt以及NF-кB细胞信号通路在青藤碱诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡过程中的具体机制，为传统中药青藤碱用于临床治疗乳腺癌提供实验依据。

青藤碱是从青风藤根茎中提取出的生物碱单体，是该中草药的活性成分，被应用于治疗各种风湿及类风湿疾病。青藤碱具有多种药理学活性，最近的研究更是发现其对多种肿瘤细胞有着抑制增殖、阻滞细胞周期和诱导凋亡的作用。然而青藤碱对于乳腺癌是否有作用并未见相关研究，因此本课题从乳腺癌的增殖、侵袭和血管生成三个方面对于这一问题进行了探索。通过体外研究我们发现，青藤碱对多种乳腺癌细胞系均有抑制增殖的作用，且呈时间-剂量依赖性。青藤碱可以使乳腺癌细胞系MDA-MB-231（三阴性）和MCF7（Luminal型）发生G1/S期阻滞并通过线粒体途径诱导细胞凋亡，同时伴有ATM/Chk2和ATR/Chk1介导的DNA损伤修复。机制研究发现药物处理后的细胞内MAPK信号通路活化增强，同时活性氧族（ROS）也显著增加，而ROS抑制剂（NAC）几乎完全抵消了盐酸青藤碱诱导的DNA损伤，但对MAPK信号的表达无显著影响，提示MAPK介导的乳腺癌细胞凋亡中ROS依赖和非依赖的途径均参与了青藤碱的抗增殖作用。在MDA-MB-231裸鼠移植瘤模型中我们也观察到青藤碱可以抑制肿瘤的生长，调节凋亡相关蛋白的表达和MAPK信号通路的磷酸化水平。在4T1和MDA-MB-231两种高侵袭性乳腺癌细胞系中我们发现，青藤碱可以显著抑制细胞的侵袭和迁移。进一步的研究显示青藤碱可以抑制IL-4的分泌，降低miR-324-5p的表达，从而增加靶基因CUEDC2的水平，进而阻断IKK的磷酸化，抑制NF-κB的活化。而高表达miR-324-5p可以抵消青藤碱的抗侵袭和抗迁移作用，提示青藤碱是通过调节IL4/miR-324-5p/CUEDC2轴抑制细胞的侵袭和转移。此外，我们还发现青藤碱可以影响肿瘤的新生血管，体外实验显示青藤碱可以抑制内皮细胞HUVECs的迁移和小管形成能力，体内实验发现青藤碱处理组的肿瘤血管密度减少、直径增加、周细胞包被增多且血管灌注增强，瘤内缺氧得到缓解，提示青藤碱可以诱导肿瘤血管正常化。同时，伴随着血管功能的改善，化疗敏感性以及抗肿瘤免疫均得到了促进。最终表现为肿瘤的生长减慢，远处转移减少。采用抗体芯片的方法发现青藤碱能够抑制促血管生成因子（bFGF，碱性成纤维细胞生长因子）、促进抑血管生成因子（PF-4，血小板因子-4）的表达和分泌，提示青藤碱诱导血管正常化的潜在机制与其恢复血管生成因子间的平衡有关。