葡萄糖6磷酸脱氢酶调控足细胞氧化还原失衡介导糖尿病肾病发病的机制研究

Podocyte injury occurs early in the development of diabetic nephropathy (DN), which is related to proteinuria and glomerulosclerosis. The mechanism for podocyte injury is not fully understood. Glucose 6-phosphate dehydrogenase is the rate-limiting enzyme in the pentose phosphate pathway which is the major source for NADPH, an important cofactor for redox components. Our previous work showed that hyperglycemia and hyperlipidemia caused significant decrease of both G6PD protein expression and activity, which led to accumulation of ROS and apoptosis of podocytes. In STZ-induced type 1 diabetic mice, Akita diabetic mice and db/db mice, G6PD protein expression in kidney tissues was significantly decreased. While in G6PD deficient mice, we showed that G6PD deficiency caused increased albumin excretion and podocyte excretion, which suggested that G6PD was critical for maintaining redox balance and podocyte survival. In this research proposal, we will use podocyte culture, G6PD overexpression transgenic mice and diabetic mice to explore the role of G6PD in hyperglycemia and hyperlipidemia-induced podocyte injury and relevant mechanisms involving redox signaling pathways and G6PD protein degradation. This project may provide potential new treatment targets for diabetic nephropathy.

足细胞损伤出现在糖尿病肾病早期，参与蛋白尿的发生与肾小球硬化，其机制不明。葡萄糖6磷酸脱氢酶（G6PD）是磷酸戊糖通路的限速酶，主要合成NADPH。我们前期研究发现，高糖、高脂能显著下调足细胞G6PD蛋白表达并导致ROS堆积、凋亡增加，而过表达G6PD则能逆转上述异常；在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠、Akita 1型糖尿病小鼠及db/db糖尿病小鼠的肾脏，其G6PD蛋白表达均显著下降，而G6PD mRNA没有变化；在G6PD缺陷小鼠，我们观察到其尿白蛋白排泄增加、尿足细胞排泄增加，提示G6PD对维持足细胞氧化还原平衡及生存有重要作用。本课题将利用足细胞培养、G6PD转基因小鼠（已构建成功）及糖尿病小鼠，阐明G6PD在高糖诱导的足细胞损伤中的作用及对氧化还原平衡的调控机制，明确高糖下调G6PD蛋白表达的机制，并探讨是否通过调控G6PD可以保护足细胞及糖尿病肾病，为临床防治提供靶点。

糖尿病肾病是糖尿病最常见的微血管并发症之一，其具体发病机制不明。目前认为糖尿病肾病的发病机制主要包括多元醇通路、蛋白激酶C、炎症、氧化应激等。其中氧化应激是一条重要通路。过多的活性氧化物质（ ROS）的产生是机体抗氧化系统和氧化系统失衡的结果，而抗氧化系统发挥作用离不开NADPH的参与。体内的NADPH主要来自磷酸戊糖途径，G6PD是磷酸戊糖途径的限速酶。各种原因导致G6PD活性的下降及NADPH的水平降低会直接影响这些抗氧化系统的。本研究主要探讨高糖调控足细胞G6PD蛋白表达的机制。小鼠肾小球足细胞根据不同实验目的分为：正常葡萄糖、高浓度葡萄糖、高渗对照组、高葡萄糖并过表达G6PD腺病毒、高葡萄糖并转染空载腺病毒。收取细胞检测G6PD蛋白表达、G6PD mRNA水平。HEK293t细胞根据不同的实验目的分组。构建Flag-G6PD、HA-VHL和His-Ub质粒，对HEK293t进行质粒转染。利用酵母双杂交实验筛选与G6PD相互作用的蛋白。利用免疫共沉淀的方法验证蛋白之间的相互作用。利用体内泛素化实验验证VHL 对G6PD 泛素化修饰的影响。 利用质谱筛选G6PD可能的泛素化修饰的位点并进行位点突变。主要结果如下：1、高糖组较正常糖组G6PD蛋白表达显著降低，高糖培养中加入蛋白酶体抑制剂MG132，G6PD蛋白水平升高。2、高糖能降低NADPH及GSH/GSSG、升高ROS水平；过表达G6PD能改善上述氧化应激指标。3、不同周龄的G6PD缺陷的小鼠，其肾脏足细胞的数量是明显低于野生对照组。4、酵母双杂交实验筛选出G6PD的可能的E3酶VHL，并利用免疫共沉淀方法证实G6PD和VHL 的体内结合作用。5、VHL 增加泛素化修饰赖氨酸366和403位点增加G6PD 的泛素化降解。结论：VHL通过增加G6PD的泛素化修饰降解导致足细胞的损伤。从高糖、高脂下调足细胞 G6PD 蛋白表达而导致氧化还原失衡、ROS 堆积、致足细胞凋亡的通路来阐明糖尿病足细胞损伤的新机制，以及可能为以后糖尿病肾病的治疗提供新的治疗靶点。