缩泉益肾方通过外泌体miRNA2861调节INS/PI3K/FOXO1信号通路干预肾阳虚证糖尿病肾病的机制研究

Diabetic nephropathy causes serious harm to diabetic patients and society due to its high lethality rate, and it’s clinical treatment effect was not significant.So DN’s preventive treatment is very important.In clinical treatment,suo-quan-yi-shen formula treat DN have effect,But the mechanism is unclear.FOXO1 gene is an important target in the INS/PI3K/FOXO1 signaling pathway,which is belong to exosome miR-2861 target gene.Previous studies have found that The efficacy of fructus alpiniae oxyphyllae for DN mice model’s kidney,will up-regulated two exosomes such as miRNA-378 and down-regulated five exosomes such as miRNA-129.And these miRNA involved multiple pathways related to DN.In this study, we construct the inhibition of mir-2861 plasmid and ransfected FOXO1 lentivirus virus vector model animal and high sugar renal tubular epithelial cells,after use suo-quan-yi-shen formula,we use real-timePCR to observe miR-2861 and INS、PI3K、FOXO1 etc mRNA’s expression;Western blot、Immunohistochem ical staining、ELISA detection INS/PI3K/FOXO1 signal pathway key molecules INS、PI3K、FOXO1 etc.Protein expression level,to research suo-quan-yi-shen formula intervene with kidney Yang deficiency type (syndrome types of TCM) and DN’s mechanism.

糖尿病肾病因其较高的致死致残率给糖尿病患者和社会带来严重危害，临床治疗效果不佳，因此DN的防治非常重要。临床上缩泉益肾方治疗DN有效，但机制尚不明确。外泌体miR-2861的靶基因FOXO1是DN发生过程中重要信号途经INS/PI3K/FOXO1中的一个关键靶点。前期研究发现：益智仁对DN小鼠肾脏中，miRNA-378等2个上调，miRNA-129等5个下调，这些miRNA涉及到与DN相关的多条通路。本研究通过构建抑制miR-2861质粒及转染FOXO1慢病毒载体模型动物及高糖的肾小管上皮细胞，使用缩泉益肾方后，用real-timePCR观察miR-2861及INS、PI3K、FOXO1等mRNA的表达；Western blot、免疫细胞组化、ELISA检测INS/PI3K/FOXO1信号途径关键分子INS、PI3K、FOXO1等蛋白的表达水平，研究缩泉益肾方干预肾阳虚证糖尿病肾病的机制。

糖尿病肾病(DKD)发病率、死亡率高，给社会经济及人类健康造成严重的负担。缩泉益肾方(SQYSF)是基于海南地域因素结合DKD病证特点凝练而成的方剂，在肾阳虚型DKD早期的多尿期广泛应用，但机制尚不明确。本课题主要研究SQYSF通过调节外泌体miRNA-2861的表达干预INS/PI3K/FOXO1信号通路，进而发挥肾脏细胞保护的分子机制，为SQYSF治疗DKD提供科学依据。研究结果表明：在体内，SQYSF可有效降低DKD小鼠的血糖、UA、UCr及UN等水平，减轻肾脏组织病理性损伤，对DKD小鼠起到显著治疗作用。与db/m组比较，db/db组小鼠肾组织miRNA-2861表达水平上调、miR-346表达下调；经SQYSF干预后，小鼠肾组织miRNA-2861表达水平下调、miR-346表达上调；在体外，SQYSF含药血清能够提高高糖胁迫下HK2细胞的活力，降低凋亡率，且中剂量效果最优。与正常HK2细胞相比，经高糖干预后的细胞外泌体miRNA-2861的含量提高；SQYSF含药血清能够抑制高糖胁迫下细胞外泌体miRNA-2861的含量。这一研究结果说明外泌体miRNA-2861是SQYSF抗DKD的关键靶点。通过构建miRNA-2861 mimic/inhibitor载体，并将病毒载体转入HK2后，检测相关基因的表达，证实了高糖胁迫下的HK2细胞能通过促进miRNA-2861表达，进而促进INS、PI3K，抑制FOXO1的表达；SQYSF含药血清减轻高糖胁迫下的细胞损伤是通过下调miRNA-2861的表达进而抑制INS、PI3K及促进FOXO1的表达，进而发挥治疗作用。与此同时，课题组还探讨了miR-346在SQYSF抗DKD的作用机制。通过数据库预测及双荧光素酶基因报告实验验证Smad4 3'-UTR区域上存在miR-346的结合位点；通过构建miR-346 mimic/inhibitor载体，并将病毒载体转入HK2后，检测相关基因表达，证实高糖胁迫下的HK2细胞能通过下调miR-346进而促进TGF-β1/Smad4信号通路相关基因的表达，SQYSF含药血清减轻高糖胁迫下的细胞损伤是通过增强miR-346的表达进而抑制TGF-β1/Smad4通路发挥了其有效治疗作用。该课题研究SQYSF温肾补阳，保护肾阳虚型DKD的机制，为SQYSF临床治疗DKD提供科学依据。