益智仁-乌药调控线粒体氧化应激治疗肾阳虚型糖尿病肾病的机制研究

Early prevention is very important for diabetic nephropathy (DN), formulas mainly composed of Yizhi Ren and Wuyao are widely used in treatment of Yang-deficiency type DN during the early period of diuresis though the mechanism are not clear. Mitochondrial oxidative stress can induce structural changes in mitochondrial proteins and DNA, ultimately causing mitochondrial permeability transition. We aim to study the process of mitochondrial oxidative stress in couplet medicines of Yizhi Ren and Wuyao by both overall experiments and in vitro experiments (changes inmesangial cells under high glucose environment), and also to explore the mechanism of warming kidney and tonifying Yang of Yizhi Ren and Wuyao for treating Yang-deficiency type DN from aspects of mitochondrial structure (Cu/Zn-SOD, Mn-SOD, GPx, thiol, PARL, MDA and protein carbonyl), function (△ψm, NAD[P] H, mitochondrial electron flow) and subsequent MPT and CDPs release (AIF, EndoG and Cyt c, caspase-9, caspase-3, 8-oxoG DNA, mitochondrial swelling, p66Shc protein expression). We are trying to provide theory basis for the use of couplet medicines of Yizhi Ren and Wuyao in treatment of DN in the hope of shedding light on TCM treatment of DN from aspect of mitochondrial oxidative stress.

糖尿病肾病的早期防治非常重要，临床上以益智仁乌药为主的方剂在肾阳虚型DN 早期的多尿期有广泛应用，但机制尚不明确。线粒体氧化应激，可诱导线粒体蛋白质和DNA的结构改变，最终引起线粒体通透性转变的出现。本研究拟以整体和体外实验(高糖环境下系膜细胞的变化)两部分，从线粒体结构（Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、GPx、thiol、PARL、MDA、蛋白质羰基）、功能（△ψm、NAD[P]H、mitochondrial electron flow）及后续MPT及CDPs释放（AIF、EndoG和Cyt c、caspase-9、caspase-3、8-oxoG DNA、mitochondrial swelling、p66Shc蛋白表达）研究益智仁-乌药温肾补阳，保护肾阳虚型DN的机制，为益智仁乌药临床治疗DN提供理论依据，并有望进一步丰富以线粒体氧化应激为切入点的DN的中医药防治手段。

项目的背景、主要研究内容：糖尿病肾病的早期防治非常重要，临床上以益智仁乌药为主的方剂在肾阳虚型 DN 早期的多尿期有广泛应用，但机制尚不明确。线粒体氧化应激，可诱导线粒体蛋白质和DNA的结构改变，最终引起线粒体通透性转变的出现。本研究拟以整体和体外实验(高糖环境下系膜细胞的变化)两部分，从线粒体结构（Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、GPx、thiol、PARL、MDA、蛋白质羰基）、功能（△ψ m、NAD[P]H、mitochondrial electron flow）及后续 MPT 及 CDPs 释放（AIF、EndoG 和 Cyt c、caspase-9、caspase-3、8-oxoG DNA、mitochondrial swelling、p66Shc 蛋白表达）。.重要结果、关键数据：1、发现“益智 － 乌药”石油醚部位组的Scr、BUN 显著低于模型对照组( P＜0.05) ，其显示出良好的保护肾脏作用，因此石油醚部位是益智-乌药药对的抗糖尿病肾病的有效部位。.2、发现在属级的水平上，db- / db-H2O的布劳特氏菌属、疣微菌科和标记S24-7的相对丰度降低（P <0.05）。db- / db-AOE500的阿克曼菌和拟杆菌相对丰度急剧增加，但螺杆菌和布劳特氏菌属相对丰度降低。db- / db-AOE500阿克曼菌增加了九倍和拟杆菌增加34％，同时螺杆菌降低了99.8％和布劳特氏菌属降低43.7％，结果显示，Akkermansia可能是db- / db-小鼠的关键目标用AOE处理。这些结果表明益智仁提取物可以调节T2DM小鼠的肠道微生物群。 .3、“益智 － 乌药”醚提取物20g/kg组可使DN小鼠的肾小球 P27kip1基因和蛋白表达水平明显下降。.4、研究发现，在db / db小鼠中，膳食补充益智仁提取物能通过阻止线粒体脂质氧化来缓和线粒体功能障碍，从而改善NO产生和氧消耗，以及从db / db小鼠肝脏分离的线粒体中的ATP酶活性。作为一种传统的功能性食品添加剂，AOE广泛用于食品和药物制剂中，可作为T2DM治疗的良好替代品。.科学意义：研究益智仁-乌药温肾补阳，保护肾阳虚型 DN 的机制，为益智仁乌药临床治疗DN提供理论依据，并有望进一步丰富以线粒体氧化应激为切入点的DN的中医药防治手段。