宿主SCL11A1基因对人巨噬细胞免疫防御功能调控作用研究

SLC11A1基因作为人类结核病最具研究价值的易感基因，在影响宿主巨噬细胞免疫防御机制的遗传学因素中占有重要地位，其表达于巨噬细胞吞噬溶酶体膜上，通过改变胞内环境抑制MTB的增殖，产生抗结核病的多效作用。我们拟通过RNA干扰技术，结合前期所筛选出的结核易感相关多态性位点，构建针对我国人群该基因不同多态性mRNA的慢病毒表达质粒，在巨噬细胞内沉默该蛋白表达，经结核杆菌有毒株攻击后，利用激光共聚焦扫描显微镜观察细胞形态学、铁离子的转运与细胞凋亡情况；应用流式细胞仪及酶联免疫技术检测NO的产生、MHC-II分子表达以及细胞因子产生。通过对上述指标变化来评价SLC11A1基因对巨噬细胞调控作用，揭示SLC11A1基因外显子区的多态性可能会导致SLC11A1基因的功能缺陷，进而导致机体结核病的发生。该课题的完成为结核病分子发病机制的研究、新型疫苗的研发及今后的免疫治疗奠定重要的理论基础。

本项目结合前期所筛选出的结核易感相关多态性位点研究该野生型基因和突变型基因的功能差异；并在人群中对野生型和突变型基因是否参与细胞因子分泌的调控进行了检测和分析；另外通过RNA干扰技术，在人的巨噬细胞内沉默该蛋白表达，利用激光共聚焦扫描显微镜观察细胞形态学变化、溶酶体的酸化，检测TLR4和MHC-II分子表达，经结核杆菌有毒株攻击后，进行NO的合成、转录因子的激活以及细胞因子的表达等指标的检测。主要有以下科学发现：（1）本研究虽然并未证实D543N变异改变了SLC11A1蛋白的功能；但是通过对对转染野生型SLC11A1质粒的293T细胞其转染前后基因表达情况进行分析发现，SLC11A1基因具有免疫调控作用，能上调包括LTA、MST1R、SH2D2A、PLA2G4D等在内的免疫相关基因；另外通过对人群中SLC11A1-D543N不同等位基因携带者的细胞因子表达情况研究，发现该SNP变异可使IL-1β细胞因子的分泌降低，IL-10细胞因子的分泌增加，因此本研究推测D543N多态性应该是通过特定的机制对细胞因子进行了调控，某种程度上发挥了类似SLC11A1基因敲低的生物学效应，进而参与了结核病的发病。（2）另外，在SLC11A1基因对巨噬细胞调控作用的研究中，发现TLR4的表达部分受SLC11A1基因的调控，与其表达水平正相关；在SLC11A1基因敲低的细胞中，p65的激活受到抑制、IL-10的表达增高、IL-1β的表达降低。本结果与SLC11A1-D543N突变等位基因携带者外周血细胞接受结核分枝杆菌刺激后IL-1β分泌降低、IL-10分泌增加相一致。两者共同提示，SLC11A1-D543N突变的抗结核免疫表现部分等同于SLC11A1基因低表达的免疫表现。该课题的完成不仅对了解SLC11A1基因的功能及其下游的信号通路具有非常重要的意义，而且其研究结果可为结核病分子发病机制的研究、新型疫苗的研发及今后的免疫治疗奠定重要的理论基础。