禽源空肠弯曲菌对人致病的毒力基因贮库研究

空肠弯曲菌是全球范围内主要的动物源性人兽共患、细菌性肠道病原菌之一，特定血清型空肠弯曲菌感染后引起的自身免疫反应可导致格林－巴利综合征（GBS），表现为四肢软瘫、呼吸肌麻痹、腱反射减低等症状，医疗负担重。家禽是人空肠弯曲菌病最重要的传染源，感染动物通常无明显病症，但可长期排菌。现有研究对动物源空肠弯曲菌如何作用于人，以及如何逃避宿主免疫反应并最终致病的机制还远不明了。由于缺乏良好的动物模型，对空肠弯曲菌致病性的直接研究存在很大困难。本研究应用体内诱导抗原技术（IVIAT），分别用空肠弯曲菌感染的禽血清、人腹泻患者血清和GBS患者血清从标准株NCTC11168表达文库中筛选出反应的表达基因，对获得的序列进行比较和功能分析，建立禽源空肠弯曲菌对人致病的毒力基因贮库，初步揭示禽源空肠弯曲菌对人致病的可能分子机制，同时，也可为疫苗、诊断试剂和药物开发奠定基础。

空肠弯曲菌是全球性分布的重要的食源性病原菌。由于没有合适的动物模型可用来研究空肠弯曲菌感染人的相关机制，而体内诱导表达抗原技术是一项新型的病原菌毒力基因筛选策略，因其不需要动物模型而备受关注。本研究将IVIAT用于空肠弯曲菌的研究在国内外尚属空白。首先获得了基因组表达文库，库容量达52 700个克隆，其可以覆盖空肠弯曲菌NCTC 11168株的全基因组4次以上，片段插入正确率为83.3%～91.7%，片段大小介于400～3 000 bp，且均匀分布，IPTG诱导体外表达文库后蛋白呈现正确表达。用体外条件培养的空肠弯曲菌菌体或体外诱导表达抗原，分别对病人康复期的血清和人工感染鸡的高免血清作反复吸附处理，彻底除去血清中能识别体外表达抗原的抗体，仅保留可以识别体内诱导表达抗原的抗体组份。然后，用吸附后的人和鸡血清分别对体外诱导的基因组表达文库的抗原进行免疫识别。经过初筛和2次复筛共得到了86个阳性克隆，将其送生物公司作双向DNA测序分析，去掉其中移码表达和重复出现的克隆，最后确定了48个体内表达抗原的编码基因，其中鸡源有27个，人源21个。这些蛋白主要涉及细菌代谢（31.3%）、大分子生物合成（12.5%）、遗传信息加工（18.8%）、转导（8.3%）、调控（12.5%）及其他生物过程（8.3%），另外还有3个功能未知的蛋白（Cj0092、Cj0788、CJE1639）。用人和鸡的吸附血清还筛选到了6个共有蛋白（fabH、hemL、leuC、aspS、Cj1200、Cj8486_0361），它们可能是该菌感染人和鸡时在体内表达的共同抗原。另外我们还筛选到已经被证实的几种体内表达的毒力相关基因，如chuA，flgS，cheA，flhF，rplA，Cj0190c，Cj0100和Cj0788。采用SYBR®Green实时定量PCR法定量分析（2-ΔΔCT）比较目的基因在体内外转录水平的差异，根据IVIAT筛选得到的48个编码序列，按其类别随机选取10个基因，结果显示，Cj0100、Cj0788、Cj0284c、Cj0663和Cj1200等5个基因上调表达。初步证实IVIAT筛选所得基因为细菌体内感染过程中表达的基因，与致病作用相关。本研究首次用IVIAT方法研究了空肠弯曲菌感染人和鸡不同宿主的抗原表达谱，为解析该菌的致病机制奠定了重要基础。