空肠弯曲菌鞭毛合成新转录因子FlhF调控网络解析

Campylobacter jejuni is one of the major zoonotic pathogens in the world. Flagella and its motility are the main causative agents. FlhF is a newly discovered key regulator of flagella synthesis. Previous studies have shown that it has an important impact on the synthesis and localization of flagella, but the regulatory mechanism has not been elucidated. Our group preliminary found by EMSA that the gene may act as a novel transcription factor, but also significantly directly regulate flagellar gene synthesis. However, the function and mechanism have not been reported. The project aims at FlhF novel transcriptional regulation , constructing a series of deletional strains, and their biological phenotypes were analyzed by promoter activity assay or anything. Screening promoters and probing for its binding site by ChIP, DNase I footprinting, CRISPR or anything, followed by analyzing the effects of related promoters on reporter gene to further analysis of FlhF regulatory network in Campylobacter jejuni flagellar synthesis. Finally, screening the interacting proteins by BiFC, Co-IP and Pull Down to parse the transcriptional coupling mechanism, which enrich and perfect the transcription regulatory network of flagella synthesis. The project aims at resolving regulatory network of a novel transcription factor FlhF in Campylobacter jejuni flagella synthesis, clarifying the mechanism of key virulence regulation and providing new ideas for preventing and controlling the infection of the bacterium.

空肠弯曲菌是世界范围内主要的人兽共患病病原菌之一，鞭毛及其介导的运动性是其主要致病因素；FlhF是新发现影响鞭毛合成的关键调控因子，现有研究显示其对鞭毛合成及定位具有重要影响，调控机制仍未阐明；前期课题组通过EMSA初步发现该基因可能作为新型转录因子，更直接显著调控鞭毛基因合成，但该功能未见报道。本项目以FlhF新型转录功能为突破点，构建系列缺失株，以启动子活性测定等方法解析其生物学表型；通过ChIP、DNase I足迹检测、CRISPR及系列蛋白构建表达等技术手段，筛选启动子并探究其结合位点，解析相关启动子对报告基因抑制/激活效应；采用BiFC、Co-IP、Pull Down等技术筛选互作蛋白，解析转录偶联机制，丰富并完善其对鞭毛合成的转录调控网络。该项目的开展将以全新视角解析空肠弯曲菌鞭毛基因转录调控机制，为该菌防控感染提供新思路。

空肠弯曲菌是世界范围内主要的人兽共患病病原菌之一，鞭毛及其介导的运动性是其主要致病因素；FlhF是新发现影响鞭毛合成的关键调控因子，现有研究显示其对鞭毛合成及定位具有重要影响，调控机制仍未阐明；前期课题组通过EMSA初步发现该基因可能作为新型转录因子，直接调控鞭毛基因合成，但该功能未见报道。本项目主要以FlhF新型转录功能为突破点，对其功能展开了相关研究。为探究FLhF生物学表型，EMSA实验显示FlhF不具备自转录调控功能。进一步构建了flhF缺失株及及其与3个结构域的回复株，通过运动力实验及透射电镜观察实验发现，flhF缺失后运动力及鞭毛完全缺失，分别回复B、N、G结构域均不能恢复鞭毛及运动表型。为进一步探究各结构域对于flhF功能的影响，同时回复双结构域，运动力实验及透射电镜观察发现，双结构域仍不能回复鞭毛及运动力表型。表明FlhF蛋白的任何一个结构域对于其在鞭毛合成中功能发挥都至关重要。 .考虑FlhF在鞭毛合成中重要性，推测FlhF除了前期报道的间接调控外，还可能直接调控鞭毛基因转录表达。RNA-Seq结果显示，共获得99个具有显著差异表达的基因（Fold change＞2，P＜0.01），其中鞭毛基因占26%（26个）。将所有鞭毛基因按照转录级联层次及功能相关性进行聚类分析发现FlhF整体影响鞭毛基因下调表达。从RNA-Seq结果中随机选择了6个显著性变化的鞭毛基因， EMSA及ChIP-qPCR实验结果证实，FlhF可与flgI启动子结合进而正调控flgI基因的表达。为探究FlhF在PflgI上的具体结合位点，将flgI启动子分为六个片段，EMSA及LacZ报告质粒测定实验探究发现，FlhF在PflgI上的具体结合序列为“AAGAAATTTGGATCAACTAGCTTAAG”。已知鞭毛合成过程中的关键调控因子有RpoD，RpoN，FliA，FlgSR TCS，EMSA及LacZ报告质粒测定分析发现，FlhF可与rpoD，fliA，flgS的启动子结合。因此，推测FlhF可能通过结合rpoD，fliA的启动子，直接调控鞭毛I类和III类鞭毛基因的表达；通过结合flgS的启动子，影响FlgR磷酸化，进而刺激σ54因子，间接调控二类基因的表达。此外，FlhF也可直接调控特定鞭毛II类基因flgI的转录表达，最终在鞭毛合成过程中起到整体调控功能。