基于肾病综合征模型及AVP-NOS/NO-AQP2途径研究当归芍药散活血利水作用机制及物质基础

As Danggui Shaoyao San (DSS) is a classical formula, which representatives the therapeutic role of invigorating blood and promoting diuresis. Our preliminary studies on dysmenorrhea and cirrhosis indicated that the mechanism of DSS treating on blood stasis and water stagnation was by influencing arginine vasopressin (AVP) system. But the link between the effect of invigorating blood and the effect of promoting diuresis is remains unknown, the pharmacodynamic material basis is unclear. Our project carry out on DSS and nephrotic syndrome as the pointcut to clarify the hypothesis: the mechanism of DSS treating for nephrotic syndrome may be by influencing AVP-NOS/NO-AQP2 system. To clarify the targets and mechanism of DSS, we investigate the certain indicators of DSS and its different compatibility group by whole animal and cell experiments. We proposed the tactic of “multi-dimensional spectrum-effect relationship combined with component knockout”to identify the main pharmacodynamic material basis through the following steps: first, constructing the “spectrum-effect” relationship between fingerprint of serum containing DSS and the key efficacy indicators to determine the target components; second, by the developed strategy based on knockout of bioactive components using a combination of column chromatography and preparative HPLC for knocking out the target components; third, investigating the activity of target components in vitro. This research lay the foundation on the study of mechanism and pharmacodynamic material basis of DSS and provides idea and method for reference.

当归芍药散是活血利水治法的代表方剂，通过前期对痛经、肝硬化腹水等疾病模型的研究，表明其活血利水作用与精氨酸加压素途径有关。但活血作用和利水作用二者如何关联及相关的物质基础等仍然不清楚。本项目以当归芍药散临床疗效确切的肾病综合征疾病模型为研究切入点，提出当归芍药散治疗肾病综合征的主要作用环节是AVP-NOS/NO-AQP2系统的工作假说，以整体动物和细胞实验研究当归芍药散及其不同配伍的干预作用，阐明当归芍药散的主要靶点和作用机制；以含药血清指纹图谱和重点药效指标构建“谱-效”关系，确定待敲除目标成分；采用成分敲除策略，以不同时间段组分为单位逐一敲除目标成分，再由体外实验考察目标成分的活性，以此辨识主要有效成分。本课题研究为进一步深入、全面地阐明当归芍药散活血利水作用机制和物质基础奠定基础，并为其他中药复方的研究提供思路和方法借鉴。

肾脏集合管对水的重吸收主要依赖AQP2的调控，AQP2是研究各种原因引起的水平衡失调的潜在靶点。既往研究表明血管通透性因子NO参与到肾病综合征水肿的形成。活血利水治法代表方剂当归芍药散对肾病综合征有较好的治疗效果，但其作用机制及药效物质基础仍不清晰。本项目基于前期工作基础，在动物和细胞水平研究当归芍药散对AVP-NOS/NO-AQP2系统的调节作用，网络药理学结合代谢组学技术进一步探讨其主要药效物质基础。本研究解析了当归芍药散提取液中50个化学成分，辨识了指纹图谱中芍药苷、洋川芎内酯类等血中移行成分。尿液代谢组学结果表明当归芍药散可调节13个肾病综合征差异标志物，主要与氨基酸代谢和能量代谢相关。结合网络药理学技术，明晰了当归芍药散及其拆方成分、靶点与标志物间网络关系，提示TNF可能是当归芍药散治疗肾病综合征的关键靶点，有机酸类和单萜糖苷类可能是其主要药效物质。在肾病综合征短周期可兴奋NOS-NO途径，增加AQP2的表达；在肾病综合征长周期内NOS活性及表达降低，抑制V2受体能增加NOS表达，但进一步抑制了NOS活性。给予AVP刺激细胞，提示iNOS和nNOS的改变可被AVP V1a受体和V2受体调控。给予当归芍药散治疗可发挥类似于V2受体拮抗剂作用调节NOS表达，进而降低AQP2，改善水液潴留状态。此外，当归芍药散可能激活IMCD3细胞cAMP-PKA-CREB通路，同时上调Na+-K+-ATP表达及活性，从而维持水液平衡。利用微生物分离培养技术揭示了当归芍药散组方之一的川芎关键成分川芎嗪（四甲基吡嗪）可能是内生枯草杆菌代谢产生，药效学实验证实川芎嗪也具有活血化瘀的作用。此项目的完成，阐明了NOS-NO-AQP2系统在肾病综合征中的关系，揭示了当归芍药散作用机制及主要药效物质，为其临床应用提供了理论依据和实验基础。