葡萄果实成熟发育过程液泡差异蛋白的甄别与功能鉴定解析液泡糖份单向优势运输和累积的实现

糖含量是葡萄品质最重要的基础指标。成熟期葡萄果肉细胞液泡内大量累积糖份，而始熟前液泡几乎无糖份累积。目前对启动和实现果肉细胞累糖的机理仍不清楚。葡萄基因组预测编码65个蔗糖和己糖转运蛋白，其中绝大多数的功能和亚细胞定位尚未验证，也未发现导致液泡大量累糖的关键功能蛋白。葡萄果肉细胞液泡随果实发育和成熟所发生的体积、双向跨膜转运活性及特征性蛋白质组成的决定性变化，是探索液泡最终实现糖份累积功能的关键。本项目依托差异荧光定量蛋白质组学和交叉免疫共沉淀技术，分离鉴定葡萄果实果肉细胞累糖前后液泡膜和液泡内差异蛋白；采用特异性抗体封闭、糖转运蛋白专一性抑制、同系底物竞争和放射性配体结合测定和免疫钓取技术，甄别不同时期液泡内向和外向糖份运输通量差异的调控蛋白，通过葡萄体细胞重组超表达体系验证累糖功能蛋白，深入解析决定葡萄成熟过程果肉细胞液泡实现累糖功能的关键作用蛋白，及其动力学特性与调控机理。

果实糖含量是鲜食和酿酒葡萄品质最重要的基础指标。成熟期果实果肉细胞液泡大量累积糖分，而始熟前液泡几乎无糖分的累积。目前对启动和实现果肉细胞累糖的机理仍不清楚。葡萄基因组预测编码65个不同糖转运蛋白，其中绝大多数的功能和亚细胞定位尚未验证，也未发现导致液泡大量累糖的关键功能蛋白。葡萄果肉细胞液泡属裂解型液泡，随果实发育、生长和成熟，液泡的形状、体积、生理活性及相应的液泡特异性蛋白质组成发生程序性变化，最终形成液泡糖分累积功能。.本项目依托蛋白质组学，分离鉴定葡萄果实果肉细胞累糖前后液泡膜和液泡内差异蛋白；采用特异性抗体封闭、糖转运蛋白专一性抑制、同系底物竞争和放射性配体结合测定和免疫钓取技术，甄别不同时期液泡内向和外向糖分运输通量差异调控蛋白，通过葡萄体细胞重组超表达体系验证累糖功能蛋白，辅以转录组和代谢组技术，深入解析葡萄成熟过程果肉细胞液泡实现累糖功能的蛋白质控制及相互作用机理。.本项目执行期间完成了葡萄不同发育时期果实样品的收集、分割和果实基本数据的测定分析；用薄层层析法分离了两个葡萄品种果实在三个关键发育时期糖的种类及果蒂和果梗中糖的种类；实施了葡萄果实愈伤组织的诱导与继代，并对葡萄薄壁愈伤组织中代表性糖转运蛋白的表达水平完成了半定量RT-PCR的测定；获得了葡萄液泡膜己糖转运蛋白VvTMT3超表达烟草，对不同转基因株系糖处理条件下的生长和蔗糖、果糖、葡萄糖含量进行了整株和叶圆片测定；建立了葡萄果实液泡14C-糖分转运动力学测定体系，分别采用同位素标记的葡萄糖、果糖和蔗糖，对不同发育期果实液泡膜对糖的内向运输能力进行了测定；对克隆的预测定位于液泡膜上的葡萄VvTMT2、VvTMT3、定位于质体上的VvPGLT转基因烟草的液泡对糖的转运能力进行了测定，发现VvTMT2和VvTMT3具有低葡萄糖和果糖转运能力，对蔗糖无转运能力，初步判断它们的功能可能与大量的质膜单糖转运蛋白相似，主要是对微环境的糖水平进行感知，而不是实现果实成熟期果肉细胞液泡大量累糖的关键转运蛋白；建立了冷冻葡萄液泡囊泡提取体系，通过差异蛋白质点的挖取鉴定出第一批液泡膜蛋白；制备了前期克隆获得并进行了功能验证的三个葡萄液泡膜单糖转运蛋白VvTMT1、VvTMT2、VvTMT3的抗体；完成了葡萄不同发育时期果实细胞液泡的提取纯化和蛋白质的分离鉴定，对得到的493个蛋白质进行了分析和整理；完成了葡