限氮培养条件下圆红冬孢酵母油脂积累的分子机制

营养失衡（氮、磷、硫等元素单一缺乏或组合性缺乏）可激发产油微生物的脂质积累，但其信号响应的分子基础、油脂过量积累的分子机制尚不清楚。针对于此，在圆红冬孢酵母全基因组从头测序及其遗传操作系统成功构建的工作基础上，本项目拟以产油性状优良的R. toruloides为研究对象，结合RNA测序技术和生物信息学分析，以限氮培养为诱因，获得响应低氮胁迫的差异表达基因全长序列；通过酿酒酵母功能互补分析、靶基因敲除、基因过表达和凝胶迁移率实验等分子生物学方法，解析圆红冬孢酵母响应低氮培养、导致油脂积累的转录因子的功能，及其与应答元件间的相互作用，揭示圆红冬孢酵母限氮培养条件下油脂积累的分子机制。本研究将加速油脂替代石化资源生产化学品新途径的构建，促进碳氢经济向碳氢氧经济的转变。本项目还可获得大量生物学新材料，对理性设计产油酵母新性状，开展油脂合成生物学研究等具有重要意义。

本研究基于多组学研究策略，结合酿酒酵母功能互补分析、靶基因敲除、基因过表达和生物信息学分析等分子生物学方法，首次发现：（1）低氮胁迫导致圆红冬孢酵母下调了NPR2（Npr2/3）表达水平从而抑制氮响应全局性调控因子TOR复合物1的活性，含氮大分子（核酸和蛋白质）生物合成受阻并激活细胞自噬通路，冗余细胞器和胞质成分降解，通过胞质重构为油脂积累和脂滴形成提供生源空间；（2）低氮胁迫导致圆红冬孢酵母氮源转运相关蛋白、氨基酸透性酶、替代氮源利用相关蛋白，以及由谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶组成的中心氮代谢通路表达上调；（3）液泡蛋白酶（如Cps1、Rpb1 和Pep4），自噬相关的液泡ATPase（Vma4、Stv1、Vma13、Vma2）、液泡脂肪酶和液泡α-甘露糖酶 (Ams1)、液泡氨基酸透性酶Atg22、Avt1、Avt4等表达上调；自噬产物（氨基酸和脂肪酸）回收利用相关的线粒体β-氧化途径蛋白（如Acd1、Acd2、Acd6、Ech1和Hcd1）表达上调；（4）胞内油脂积累相关蛋白（如Fas、Acl、Acc1等）和脂滴蛋白表达上调，胞内油脂增加，脂滴蛋白Perilipin的表达水平与油脂含量成正相关；acetyl-CoA分支点基因的表达水平显示，限氮培养时，acetyl-CoA主要流向油脂合成而不是异戊二烯基物质合成。（5）油脂生产表型涉及2000个基因的贡献，单个油脂积累关键基因的异源表达不足以赋予重组菌株油脂生产性状；（6）响应氮源胁迫，调控氮代谢阻遏效应基因表达的功能主要由GATA转录因子行使；在圆红冬孢酵母中，存在11个GATA型转录因子，并在其相应的上调表达靶基因（氮源代谢相关基因）上的上游鉴定到保守的GATA转录因子识别共性特征序列“HGATAR” (H=A, C or T, and R=A or G)。