Bmal1基因通过调控自噬通路影响α突触核蛋白寡聚体降解及其分子机制的研究

Growing body of evidence indicated that Bmal1 expression was repressed in both patients with Parkinson's disease (PD) and PD animals. Our recent association study suggested that Bmal1 was also a genetic risk factor for PD. Recently, our pilot study using α-synuclein cell model indicated that Bmal1 deficiency inhibits degradation of α-synuclein oligomers probably through modulation of autophagy pathway. To confirm those preliminary data and to understand the underlying mechanism, in the present study, we are going to employ wild type and Bmal1 knockdown MES23.5 dopaminergic neurons; Bmal1+/+ and Bmal1-/- cortical primary neurons; Bmal1-/- cortical primary neurons with exogenous expression of Bmal1 or GFP as cell model, and Bmal1+/+ and Bmal1-/- mice as animal model. ELISA will be used to quantify the amount ofα-synuclein oligomers; western blot and quantitative real time PCR will be used to examine abundance of autophagic genes and the activity of mTORC1. The present study will address that Bmal1 deficiency modulates degradation of α-synuclein oligomers through autophagic inhibition by activating mTORC1, and clarify Bmal1 related vicious cycle for PD development.

Bmal1表达下调是帕金森病(PD)患者及动物模型的共同特征，关联研究显示Bmal1还是PD致病基因，这一恶性循环可能关乎PD渐进性进展，值得深入研究。我们最新研究结果显示，Bmal1敲减能够导致细胞内自噬通路受到抑制和α突触核蛋白寡聚体增加。为进一步证实Bmal1基因对于α突触核蛋白寡聚体降解和自噬通路的调控，并阐明相关分子机制，本研究将使用Bmal1敲减、敲除、敲除后恢复表达等细胞和小鼠模型，通过ELISA分析α突触核蛋白寡聚体含量，通过Western blot分析自噬功能的变化，通过Western blot和定量PCR分析自噬-溶酶体通路基因的表达以及mTORC1的活性。本研究有望阐释Bmal1表达下调增强mTORC1活性，进而抑制自噬通路和α突触核蛋白寡聚体降解，最终加速PD发生发展的机制，为认识以Bmal1为核心的恶性循环提供新的视角。

突触核蛋白尤其是其寡聚体具有极强神经毒性,是导致帕金森病相关神经元损伤的元凶，而自噬通路是调控α突触核蛋白寡聚体降解的核心。我们前期的工作发现，Bmal1在帕金森病患者显著下降，并可能影响突触核蛋白寡聚体的降解。由此，我们提出研究假说，神经元中Bmal1基因能够通过影响mTORC1活性调控自噬通路，从而促进α突触核蛋白的病理改变，最终影响PD的发生发展。课题设计包括五方面内容：第一，利用细胞模型确证Bmal1影响α突触核蛋白寡聚体降解；第二，利用细胞模型确认Bmal1影响自噬通路；第三，利用细胞模型分析Bmal1影响自噬通路哪一环节；第四，利用细胞模型分析Bmal1是否以及怎样通过调节mTORC1活性影响自噬通路；第五，利用Bmal1敲除小鼠分析在体条件下Bmal1对于自噬的影响。课题实施中，首先，我们使用细胞系和原代细胞建立了突触核蛋白寡聚体细胞模型，并发现Bmal1敲减和敲除能够抑制α突触核蛋白寡聚体的降解。第二，利用免疫印记方法，我们分析了LC3II的丰度，发现Bmal1的低表达能够降低LC3II丰度。提示Bmal1的低表达可能参与抑制自噬功能或导致自噬降解通量增加。第三，为了分析Bmal1作用于自噬的环节，采用Bafilomycin A1处理细胞模型。发现，在Bafilomycin A1的作用下，野生型、Bmal1敲入、Bmal1敲除细胞中LC3II含量均显著增加。Bmal1敲除细胞中LC3II的含量显著低于野生型对照细胞。这一结果说明，Bmal1的低表达能够抑制自噬功能。第四，我们使用皮层原代神经元细胞分析Bmal1是否以及怎样通过调节mTORC1活性影响自噬通路。免疫印记结果显示，与野生型对照细胞相比，Bmal1敲除细胞中磷酸化AKT蛋白以及磷酸化AKT蛋白与AKT蛋白比值显著下降，mTOR等蛋白丰度无显著变化。提示，mTORC1并非Bmal1的主要作用靶点。第五，使用皮层原代神经元细胞分析Bmal1是否通过调控自噬通路关键节点因子转录调控自噬。结果表明Bmal1可能通过影响自噬通路关键节点因子TFEB和GBA的转录而调控自噬。本研究证实了Bmal1可能通过调控自噬影响突触核蛋白寡聚体的降解。其机制可能与影响自噬通路关键节点因子转录相关。