脂磷壁酸合酶LtaS介导的植物乳杆菌黏附效应及其机制研究

Lactic acid bacteria (LAB) can exert probiotic action through the adhesion and colonization mediated by their surface layer molecules to the intestinal mucosa. Cell surface-associated lipoteichoic acid (LTA) plays important roles in the adhesion and colonization of LAB by directly interacting with host cells. However, the molecular mechanisms of LTA-mediated adhesion to intestinal mucosa are still unclear in Lactobacillus. LTA synthase (LtaS) produces the polyglycerolphosphate chain by the repeated addition of glycerolphosphate residues to the tip of the growing chain, and therefore, LtaS is a key enzyme responsible for polyglycerolphosphate LTA synthesis. In this study, using the molecular techniques, we attempt to knock out and over-express ltaS to dissect the link between LTA changes and adhesion in Lactobacillus plantarum. By LTA phosphorus (P) determination, LTA content detected by Western blot and LTA structure analyzed by multi-spectrometric techniques, we attempt to assess the effects of LtaS on LTA levels and composition in L. plantarum. Using the adhesion model of HT-29 cells and combining with the analyses of transcriptome and proteomics, we attempt to dissect adhesion effects and the mechanism underlying LtaS-mediated adhesion. .For a subsequent adhesive competition test, we want to reveal the potential inhibition of ltaS mutation strains against pathogens attaching to intestinal HT-29 cells. We hope this study contributes to further elucidate adhesion characteristics of Lactobacillus in the intestine and lays a foundation for the development of Lactobacillus LTA-related probiotic functions.

乳酸菌通过细胞壁表面分子黏附和定植肠道细胞，发挥其肠道益生功能。细胞壁表面的脂磷壁酸（LTA）通过与肠上皮细胞直接接触在乳酸菌肠道黏附定植过程发挥重要的作用，然而其黏附相关的机制尚不清晰。LTA合酶（LtaS）通过重复添加甘油磷酸基团至LTA主链，催化多聚甘油磷酸LTA链延长，故LtaS是LTA合成关键酶。本课题运用分子生物学技术，敲除和高表达植物乳杆菌LtaS，解析LTA组成与其黏附关联。通过测定LTA磷含量、Western blot分析LTA水平和多谱手段解析LTA的结构特征，明确LtaS对植物乳杆菌LTA组成的影响；利用HT-29结肠细胞黏附模型结合转录、蛋白组学分析，解析LtaS介导的植物乳杆菌黏附效应及其机理；通过进一步竞争黏附实验，揭示LtaS介导的植物乳杆菌潜在的抑菌和抑炎效应。本课题的研究有助于进一步阐明乳杆菌的肠道黏附特性，同时为乳杆菌LTA相关的益生功能开发奠定基础。

细胞壁表面的脂磷壁酸（LTA）通过与肠上皮细胞直接接触在乳酸菌肠道黏附定植过程发挥重要的作用。LTA合酶LtaS将甘油磷酸重复单元转移至锚定于膜上的二糖基甘油二酯（Glc2-DAG）进行LTA链延长，伴随甘油二酯（DAG）生成，故LtaS是LTA合成关键酶。生物信息学分析显示脂磷壁酸合酶LtaS是具有5次跨膜结构的可溶性稳定蛋白，通过构建进化树发现乳杆菌脂磷壁酸合酶普遍存在保守的5次跨膜结构，暗示乳杆菌脂磷壁酸合酶可能具有保守的功能。将脂磷壁酸合酶LtaS进行异源表达，使用二酰基甘油（DAG）试剂盒检测LtaS催化底物小分子磷脂酰甘油（PG）形成DAG能力，并进一步评价温度、pH值、金属离子以及缓冲液中盐离子浓度对目的蛋白LtaS催化活性的影响；采用同源建模的方法预测LtaS蛋白的三维结构、Ramachandran plot评估构建模型，重组蛋白LtaS的三维模型与底物分子PG进行分子对接；借助Pymol软件分析，确定底物分子结合的关键氨基酸残基，通过氨基酸位点突变确定影响LtaS酶学特性的E259、T303、H420等关键氨基酸。通过测定LTA磷含量、ELISA分析LTA含量，核磁共振氢谱和高分辨质谱等多谱手段成功解析植物乳杆菌LTA的结构特征。为评价LTA的黏附功能，选择大肠杆菌、单增李斯特菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌4种病原指示菌，构建Caco-2细胞模型证明植物乳杆菌LTA和壁磷壁酸（WTA）具有广谱抑菌黏附效应及LTA和WTA均能够抑制4种病原菌生物膜形成，表明植物乳杆菌磷壁酸是重要的黏附分子。构建LPS诱导肠道细胞炎症模型，评价LTA对于细胞炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10表达的影响；通过Western blotting实验，阐明LTA通过MAPK和NF-κB信号途径抑制LPS诱导细胞炎症，因此，本项目深入探究LTA介导的植物乳杆菌黏附效应，为乳杆菌LTA相关的肠道益生功能开发奠定基础。