唾液乳杆菌表面S-层蛋白介导的黏附及免疫调节分子机制研究

The ability of probiotics to adhere to epithelial cells of the host intestinal tract is considered a beneficial trait for probiotic strains. The surface-layer protein (Slp) of lactobacilli was considered to be exhibited important role on the tissue adherence and host immune homeostasis. However, little is known about the precise mechanisms by which lactobacilli exert their biological effects. Lactobacilli, an important intestinal microbiota, play dominant role on the the intestinal health. In the present project, the mechanisms involving Slp of Lactobacillus salivarius as mediators of adhesion and immunoregulation will be investigated in vitro and in vivo. The whole research projects include two parts. Part one, assessment of the adhesive properties of Slp, investigation of influence on the adherence of Slp, identification of adhesion-association protein and mucus receptors. Part two, research on the immunoregulation function of Slp of L. salivarius via TLR-NF-κB signaling pathway. This research would be helpful to explain roles of commensal microbiota on building and maintaining of host immune homeostasis, and to provide a theoretical basis for the development of safe and functional dairy probiotics or probiotic agents.

黏附能力是益生菌发挥生物学作用的基础。已知S-层蛋白（S-layer protein，Slp）在益生菌黏附及免疫调节过程中起着重要作用，但具体的作用机制不清，缺乏足够的研究支持。乳酸杆菌是益生菌的成员之一，其Slp组成具有显著的菌株特异性，从而导致其对机体的黏附与免疫调节作用各有不同。本研究以课题组筛选的高黏附性唾液乳杆菌为对象，分离并鉴定菌体表面Slp，通过体内外试验探讨其对肠黏膜上皮细胞的黏附特性，进一步确定肠上皮细胞表面Slp受体；同时，利用小鼠模型研究Slp的生物保护作用及对肠道菌群的影响，并以Toll样受体介导的TLR-NF-κB信号通路为切入点，研究Slp免疫调节的分子机制，探讨Slp与免疫调节之间的相互作用。通过上述研究，揭示唾液乳杆菌的黏附及免疫调节作用机制，阐明人体肠道共生菌与宿主免疫稳态建立与维持的机理，从而为开发安全有效的功能性乳制品或益生菌微生态制剂提供理论依据。

本文研究的目的是筛选唾液乳杆菌中具有黏附性作用的表层蛋白，并对其进行基因克隆和功能分析，从而揭示唾液乳杆菌的表层蛋白黏附及免疫调节分子机制。首先利用盐酸胍提取唾液乳杆菌表层蛋白，并进行透析纯化后，通过PEG8000进行浓缩并测定蛋白浓度。利用丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的方法，将目的蛋白纯化后进行质谱分析；通过结晶紫染色和荧光素标记验证唾液乳杆菌表层蛋白的黏附性并确定其最佳的蛋白作用浓度，进而开展病原菌的相关实验。利用荧光定量PCR的方法对脂多糖作用后的Caco-2细胞的炎症细胞因子IL-8和TNF-α的检测，确定脂多糖对Caco-2细胞作用的最佳浓度和时间，进而建立炎症反应模型。再次利用荧光定量PCR的方法对经不同条件蛋白处理后Caco-2细胞的炎症细胞因子IL-8和TNF-α的检测，确定蛋白抑制炎症反应的最佳条件。利用Western blot方法，考察在炎症反应条件下，经表层蛋白作用后的Caco-2细胞中MAPK和NF-kB信号通路的P38蛋白和P65蛋白以及其磷酸化蛋白表达量的变化，初步确定免疫调控机制。经过以上实验确定蛋白作用，然后进行提取表层蛋白的正交实验，优化提取蛋白的条件。. 结果表明，唾液乳杆菌黏附性的实验结果表明，发挥黏附功能的主要是表层蛋白。而且同时发现表层蛋白在黏附Caco-2细胞的同时还可以对致病菌有一定的黏附作用。根据质谱结果进行分析发现，发挥主要黏附功能的可能是EF-Tu、EF-G等延伸因子。通过LPS的诱导，Caco-2细胞能够产生大量炎症细胞因子IL-8和TNF-α，表明了炎症模型的成功建立。在炎症模型中通过与表层蛋白在不同条件下的相互作用表明，表层蛋白对炎症的治疗效果明显强于预防效果。根据Western blot检测结果表明，在与蛋白共作用12h时MAPK信号通路中p38磷酸化的蛋白明显降低，而NF-KB信号通路中p65磷酸化的蛋白变化不明显，所以初步证明了表层蛋白发挥免疫调节功能主要是通过MAPK信号通路。. 本项目证明唾液乳杆菌表层蛋白具有黏附功能，同时表层蛋白主要是通过抑制MAPK信号通路中p38磷酸化蛋白发挥抑制机体炎症的作用，为进一步揭示表层蛋白免疫调节分子机制的研究奠定基础。