补阳还五汤维系巨噬细胞适度自噬而稳定动脉粥样硬化易损斑块的机制研究

How to improve the stability of vulnerable plaque of atherosclerosis (AS) is the key point to prevent sudden death in acute coronary syndrome. Plaque macrophages' basal autophagy may protect it from the effects of stress, and the abnormal autophagy leads to macrophage phenotype changed, promote the inflammatory factor release increased plaque instability plaque. Research shows that, PI3K - Akt-mTOR pathway is the main pathway to activate autophagy, but autophagy of macrophages in addition with the Rho kinase A, MAPK, ERK and other signal transduction pathway activation / phosphorylation related. Cold and qi stagnation blood stasis in the heart of the collaterals are the pathogenesis of vulnerable plaque, supported by the National Natural Science Foundation discovered Yiqi Huoxue Tongluo prescription Buyang Huanwu decotion significantly reduced AS plaque area, reduced the AS lesion and inhibited RhoA, MAPK, ERK1/2 phosphorylation. Upon on these foundation the project will investigate the association Buyang Huanwu decotion to stabilize the vulnerable plaques and plaque phenotype changes of macrophages autophagy and regulation mechanism, which through the ApoE-/-mouse model of vulnerable plaque and macrophage inflammatory model, to reveal that Buyang Huanwu decotion in enhancing the role of AS in vulnerable plaque stability and regulation mechanism, to provide new ideas, new target for the treatment of AS.

如何提高动脉粥样硬化(AS)易损斑块的稳定性是预防急性冠脉综合征猝死的关键。斑块内巨噬细胞基础性自噬可保护其免受各种应激物影响，而出现异常自噬将导致巨噬细胞表型改变，促进斑块内炎症因子释放破坏斑块的稳定性。研究显示，PI3K -Akt-mTOR分子通路是激活自噬主要调控通路，而巨噬细胞自噬除此之外，还与Rho激酶A、MAPK、ERK等信号转导通路的活化/磷酸化有关。寒凝、气滞、血瘀阻于心之络脉是易损斑块的病机，前期国家自然基金资助项目发现益气活血通络经方补阳还五汤明显缩小AS斑块面积、减轻AS病变与抑制RhoA、 MAPK、ERK1/2等信号通路磷酸化有关。本项目拟在前期基础上，通过ApoE-/-小鼠易损斑块模型与巨噬细胞炎症模型相结合，探讨补阳还五汤稳定易损斑块与斑块内巨噬细胞自噬及表型变化的关联及调控机制，揭示其在提高AS易损斑块稳定性中的作用及调控机制，为治疗AS提供新思路、新靶点。

在ApoE-/-小鼠复制的动脉粥样硬化易损斑块模型（AS）中，与正常组相比，模型组AS病变明显，易损指数升高，血清 hs-CRP、白介素IL-1β 和 IL-6 含量均显著升高（P<0.05）；模型组血管组织中M1期巨噬细胞较多，LC3-II含量明显降低，自噬水平下调；模型组血管组织中PI3K、mTOR、p62磷酸化程度明显升高，Beclin1磷酸化程度及ULK1蛋白表达明显降低，补阳还五汤及其雷帕霉素可以显著抑制PI3K、mTOR、p62磷酸化，促进Beclin1磷酸化与提高ULK1蛋白表达。模型组血管组织中自噬基因Atg5, 16mRNA水平与正常组、补阳还五汤组、雷帕霉素及3-MA组相比无明显差异；与正常组相比，模型组血管组织中基质金属蛋白酶（MMP-1、2、3）、4BEP mRNA水平显著升高( P<0.05)，不同剂量补阳还五汤组、雷帕霉素显著抑制MMP-1、2、3与4BEP mRNA的表达( P<0.05)。.在培养的巨噬细胞（RAW264.7）中，采用10ug/ml LPS作为巨噬细胞出现炎症的刺激因素。与空白组比较，模型组IL-1β 、IL-6、TNF-α浓度显著上升的同时LC3、p62、TIMP2、pho-PI3K、pho-Akt、pho-mTOR 、MMP1、MMP9磷酸化及其蛋白表达量显著性升高（P<0.05）；补阳还五汤含药血清与各阻断剂组显著降低IL-1β 、IL-6、TNF-α浓度与相关通路蛋白表达量（P<0.05）；模型组ULK1、p70s6k mRNA表达量显著性降低，4EBP1、Atg12的mRNA表达量显著性升高（P<0.05），补阳还五汤含药血清组及各通路抑制剂组显著性升高ULK1、p70s6k mRNA表达量（P<0.05），降低4EBP1、Atg12的mRNA的表达量（P<0.05）。与空白组比较，模型组中有明显的自噬体斑点形成；补阳还五汤含药血清组与阻断剂组自噬斑点的形成明显减少或消失。与空白组比较，CD86、CD206巨噬细胞数目显著增强（P<0.05），补阳还五汤含药血清组与模型组比较，CD86、CD206巨噬细胞数目显著降低（P<0.05）。.本课题研究提示补阳还五汤可以明显地降低不稳定斑块的易损指数，提高其稳定性，这种结果与补阳还五汤减少炎症因子的释放、促进巨噬细胞向修复型转变、调控巨噬细胞自噬有关。