补阳还五汤抗动脉粥样硬化作用与细胞间隙连接通讯功能的研究

气虚血瘀是动脉粥样硬化（AS）潜在病机，其病生基础主要表现在内皮功能障碍。相邻细胞间信息和能量物质的交换主要通过间隙连接通讯(GJIC) 实现，血管壁内皮－平滑肌细胞间的GJIC改变及连接蛋白（Cx）表达种类和水平的变化与AS的发病具有重要关系。同型半胱氨酸（Hcy）升高引起AS的致病机理与气虚血瘀相似，而氧化应激损伤占重要地位，研究证实氧化应激可导致细胞GJIC功能障碍。本课题将在ApoE基因敲除小鼠，研究Hcy对Cx的表达、空间分布和GJIC的影响，分析其与氧化应激、PKC、MAPK信号转导的相关性；研究GJIC在内皮细胞凋亡与平滑肌细胞增殖中的作用与信号转导途径；通过动物与细胞实验相结合研究益气活血化瘀经典复方"补阳还五汤"对Hcy所致AS的防治作用及其与GJIC及上下游信号转导的关系，将为拓展补阳还五汤在心脑血管疾病中的临床应用提供新的理论及实验依据，为防治AS提供新靶点。

本课题组在ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠复制的动脉粥样硬化模型（AS）中，研究补阳还五汤对血管内皮损伤的防治作用。结果显示：与模型组相比，补阳还五汤组动脉血管的斑块面积与管腔面积之比明显降低，降低血清中Hcy水平与血管中活性氧（ROS）含量；提高血管中IκB-α蛋白表达及降低p38MAPK、ERK蛋白表达水平，抑制血管壁中NF-κB活化与MAPK信号通道激活；提高血管连接蛋白（Cx）中的Cx37蛋白表达及降低Cx43蛋白表达，改善血管组织中细胞间的间隙连接通讯功能（GJIC）。.在此基础上，以内皮细胞为研究对象，结果显示：与Hcy组相比，补阳还五汤含药血清提高内皮细胞活力，抑制Hcy引起的内皮细胞凋亡，降低caspase-3.和caspase-9表达，降低内皮细胞中ROS含量及培养液中sICAM-1和TNF-α含量；上调I-κBα蛋白表达，抑制NF-κB激活，下调p38MAPK蛋白和ERK蛋白表达，提高Cx37和Cx40蛋白及其mRNA表达，降低Cx43蛋白和Cx43mRNA表达；2）Lucifer Yellow（LY）划痕标记实验中，Hcy使间隙连接通道对染料的运输增强，通道发生改变，补阳还五汤含药血清组能改善内皮细胞间的GJIC。 .在培养的平滑肌细胞中，Hcy诱导血管平滑肌细胞进入S或G2期，血管平滑肌细胞的增殖标志物PCNA表达明显增加，补阳还五汤含药血清抑制Hcy诱导的血管平滑肌细胞的细胞周期进程与PCNA的增加；上调I-κBα蛋白表达，抑制p38MAPK和ERK蛋白磷酸化，降低Cx43蛋白和Cx43mRNA表达；划痕标记实验证实补阳还五汤含药血清组能调节平滑肌细胞间的GJIC。.在内皮-平滑肌细胞共培养的体系中，补阳还五汤含药血清组显著降低Cx43蛋白的表达；透射电镜下观察发现，与正常对照组相比，Hcy处理组中的细胞间形成的缝隙连接明显减少，而补阳还五汤含药血清能够改善内皮-平滑肌细胞之间的这种缝隙连接。.本课题研究提示补阳还五汤明显改善Hcy诱导的AS病变中血管损伤，内皮细胞凋亡及平滑肌细胞增殖，与抑制氧化应激及p38MAPK、ERK、NF-κB信号转导途径的激活，改善内皮细胞与平滑肌细胞中Cx蛋白及其mRNA水平表达，修复GJIC有关。本课题研究将为拓展补阳还五汤在心脑血管疾病中的临床应用提供新的理论及实验依据，为防治AS提供新靶点。