补阳还五汤通过Rho激酶调控内皮细胞通透性抗动脉粥样硬化的机制研究

气虚血瘀是动脉粥样硬化（AS）潜在病机，其病生基础为血管内皮损伤，内皮细胞（EC）连接与细胞骨架改变致通透性增加是血管内皮损伤关键环节。而Rho激酶（ROCK）激活引起肌球蛋白轻链激酶（MLCK）活化，可使细胞骨架重排与EC通透性增加。同型半胱氨酸（Hcy）升高通过氧化应激引起AS的机理与气虚血瘀相似，氧化应激产生活性氧致细胞内Ca2+浓度升高及PKC活化，上调ROCK和MLCK活性与蛋白表达，通过p38MAPK、ERK、NF-κB等信号转导途径，破坏细胞骨架结构引起EC连接障碍，致EC通透性增加。本课题通过动物与细胞实验结合研究Hcy致AS与ROCK和MLCK、EC通透性影响及相关信号转导机制；同时探讨益气活血化瘀经方"补阳还五汤"对AS防治作用与ROCK、MLCK与EC通透性及上下游信号转导的关系，拓展补阳还五汤在心脑血管疾病的应用提供新的理论及实验依据，为中医药防治AS提供新靶点。

背景介绍：本课题拟探讨补阳还五汤抗AS作用与Rho/Rho激酶、MLCK以及上、下游的信号转导通路与细胞骨架及其细胞通透性的关系。.主要内容与研究结果：在ApoE-/-小鼠复制的动脉粥样硬化模型（AS）中，与正常组相比，模型组AS病变明显，血清Hcy水平升高，血管组织中ROCK、MLCK、P38MAPK、ERKmRNA及蛋白表达水平增高，Claudin、JAM、Occludin、ZO-1mRNA水平降低；补阳还五汤以及ROCK抑制剂Y276238组可以明显改善病变程度，降低血清中Hcy水平；下调ROCK、MLCK、P38MAPK、ERKmRNA及蛋白表达水平，上调Claudin、JAM、Occludin、ZO-1mRNA表达。.在培养的内皮细胞（Eahy926）中，结果显示与Hcy组相比，不同浓度补阳还五汤含药血清与各种抑制剂组显著降低Hcy诱导的IL-1 IL-6、 TNF-α含量与Ca2+浓度，下调内皮细胞ROCK及MLCK蛋白表达与mRNA水平，降低ROCK/MLCK、p38MAPK及ERK p44/42蛋白磷酸化水平，上调内皮细胞中连接蛋白中JAM的蛋白及mRNA水平、 ZO-1蛋白表达水平；不同浓度补阳还五汤含药血清与各种抑制剂组的内皮细胞的跨膜电阻（TEER）显著升高，降低细胞通透性，内皮细胞的应压纤维排列有序紧密。由此可知Hcy诱导内皮细胞的损伤涉及到骨架肌动蛋白重排以及细胞通透性的升高。.在培养的平滑肌细胞中，与Hcy组相比，不同浓度补阳还五汤含药血清与抑制剂组降低Hcy诱导的ROCK/MLCK与磷酸化的ROCK/MLCK蛋白表达；升高平滑肌细胞的跨膜电阻（TEER），降低细胞通透性，使得平滑肌细胞的应压纤维排列有序紧密。.在内皮-平滑肌细胞共培养的体系中，与Hcy组相比，不同浓度补阳还五汤含药血清与抑制剂组下调Hcy诱导的ROCK/MLCK与磷酸化的ROCK/MLCK蛋白表达量；升高细胞间的TEER值显示补阳还五汤能够改善细胞共培养体系中细胞间的通透性。.本课题研究提示补阳还五汤明显改善Hcy诱导的AS病变，与抑制p38MAPK、ERK、ROCK、MLCK信号转导途径的激活、抑制炎症、改善内皮细胞与平滑肌细胞的紧密连接、调节细胞骨架及改善细胞通透性水平有关。本课题将拓展补阳还五汤在心脑血管疾病中的临床应用提供新的理论及实验依据，为防治AS提供新靶点