以TolC蛋白为靶标的大肠杆菌外排泵抑制剂的筛选及耐药干预机制研究

Multiple drug-resistant efflux pump is widely existed in all kinds of pathogens and has great influence on the drug sensitivity of bacteria and the clinical treatment of bacterial infection. Therefore, Efflux pump inhibitors (EPIs) is an important way to solve the problem of bacteria resistance. However, no ideal medicine has been clinically applied in the current researches of EPIs. As a result, it is particularly important to find a clinically EPIs. Escherichia coli is used as the model bacteria and targets to constitute the outer membrane protein TolC which is the major composition of the efflux pump in which plans to use the SELEX technology to get a group of aptamer with high specificity and compatibility and take advantage of the feature that the protein activity can be restrained with the combination of the aptamer and the target protein to study the Escherichia coli multiple efflux passageway blocked by the aptamer. It will be also discussed what is the functional mechanism of inhibitor combined with the technologies of bio-nano-materials, MALDI-TOF/MS and SPR. Considering the advantages of aptamer and importance of efflux pump in multiple drug resistance, this project will not only provide a type of direct and safe technology and method with high sensitivity and specificity to the clinical intervene of Escherichia coli efflux pump, but also a new way of solving the problem of drug resistance in our country.

多重药物外排泵广泛存在于各种病原菌中, 对细菌的药物敏感性以及细菌性感染的临床治疗影响很大，所以外排泵抑制剂是解决细菌耐药问题的重要途径。然而，目前还没有理想的应用于临床的抑制剂产生，找到适用于临床的外排泵抑制剂显得尤为重要。本研究以大肠杆菌为模式菌，以构成外排泵的重要组成成分－外膜蛋白TolC为靶目标，拟通过SELEX技术筛选一组关于TolC的高特异性和亲和性的适配体，利用适配体与靶蛋白结合后能抑制蛋白质活性的特点，开展适配体阻塞大肠杆菌多重外排通道以及抑制耐药的研究；同时结合MALDI-TOF/MS、SPR、纳米磁性粒子分离等技术对抑制剂与外排泵的相互作用机制进行探讨。鉴于适配体的优势和外排泵在多重耐药中的重要作用，此项研究将为外排泵抑制剂的研究提供有力支持，为我国解决细菌耐药性的问题开辟新的思路，同时为我国耐药性的临床干预提供一种特异性强、灵敏度高和易操作的、安全的技术和手段。

大肠埃希菌(Escherichia coli)是重要的条件致病菌,极易通过多种形式和途径侵入肠道外的组织和器官, 造成各种严重感染。随着抗菌药物的临床广泛应用，诱导了大量该菌属耐药菌株的产生。研究发现大肠埃希菌主动外排泵是引起其多重耐药的重要原因之一，因此抑制大肠埃希菌的主动外排泵对解决其耐药问题具有重要的意义。本研究以大肠埃希菌外排泵外膜蛋白tolC为靶目标，重组表达后利用指数富集的配体系统进化技术(stematic evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX)从单链DNA文库中筛选出一组能够特异性与其结合的核酸适配体，并将其应用于干预大肠埃希菌的耐药研究。通过筛选获得23个适配体，一级结构分析显示23个适配体并无共同的保守序列，但分别有3对和2对适配体序列完全一致。二级结构预测分析表明，茎环结构为适配体主要的结构形式，提示其可能是适配体与tolC蛋白蛋白特异性结合的基础。根据二级结构特点可将23个适配体分为4个家族，其中20号适配体与靶标蛋白亲和力最高。其对大肠埃希菌的耐药具有一定的干预作用，使其MIC值在一定程度上下降。