AcrAB-TolC外排泵在汉赛巴尔通体诱导性耐药中的分子反应机制初探

汉赛巴尔通体是致病性革兰阴性杆菌,能引起猫抓病、心内膜炎等多种疾病。本课题组前期外膜蛋白质组学研究发现其能表达AcrAB-TolC外排泵中外膜通道蛋白TolC，同源蛋白搜索表明存在AcrAB-TolC结构基因，此泵是形成细菌多重耐药的主要机制之一。为明确汉赛巴尔通体AcrAB-TolC与耐药之间的关系，本研究拟应用测序及实时荧光定量RT-PCR技术分析AcrAB-TolC的基因分布及转录特征；利用浓度递增法体外诱导耐药，分析诱导过程中TolC的基因、转录及蛋白水平表达变化，Etest法分析对抗生素敏感性变化及诱导后的耐药谱；运用Cre/loxP系统基因敲除和遗传回补技术证实TolC的抗生素外排功能。通过本研究，明确AcrAB-TolC的抗生素外排作用、探明TolC在耐药过程中遗传突变和环境诱导机制，探索突变规律并筛选新耐药位点，对阐明巴尔通体耐药机制和指导临床用药具有重要理论和实践意义。

AcrAB-TolC泵是大肠埃希菌等多种细菌产生多药耐现象的重要机制之一，属于耐药结节分化家族，能够同时产生针对有机溶剂、染料、去污剂以及多种抗菌药物(如氯霉素、红霉素、四环素等)的高水平的多重耐药。AcrAB-TolC外排系统主要由三个部分组成，即膜融合蛋白(AcrA)、外排转运蛋白(AcrB)和外膜通道蛋白(TolC)。巴尔通体属于难培养兼性胞内寄生菌，可引起猫抓病、心内膜炎等多种疾病。本研究在前期研究基础上发现汉赛巴尔通体中存在多耐药相关外排泵外膜通道蛋白TolC，为明确汉赛巴尔通体的AcrAB-TolC系统与多耐药之间的关系，我们进行了以下研究。利用浓度梯度递增法体外诱导耐药，获得了红霉素、阿奇霉素、克林霉素、环丙沙星和强力霉素联合耐药菌株；应用质子泵抑制剂CCCP检测多耐药菌株的外排表型发现外排泵不是红霉素和环丙沙星耐药产生的主要机制，个别菌株对强力霉素和氯霉素的MICs值减低，可能存在外排作用；我们发现在诱导过程中tolC基因有1个氨基酸位点突变并与自然突变位点相同；多种抗生素诱导没有使tolC的转录水平增加，AcrAB-TolC外排泵对于这几种抗生素的多耐药的发生不起主要作用；23S rRNA的A2058G和A2058C突变是汉赛巴尔通体红霉素耐药的主要机制；gyrA在QRDR的Asp87→Asn引起环丙沙星耐药，我们在QRDR还发现了新突变位点Asp82→Asn和Ala83→Val。依据本研究，我们认为AcrAB-TolC泵对大环内酯类、喹诺酮类和四环素类抗生素耐药产生不起主要作用。本研究高效表达出TolC蛋白，免疫动物可获得高滴度抗血清，证实此蛋白具有免疫原性，可作为免疫诊断候选蛋白标记物。