绵羊皮肤毛囊miRNA的分离及其介导的基因表达调控研究

miRNA是近年来发现的一类对生命活动起重要调控作用的小非编码RNA，普遍存在于从低等生物到人类的细胞中。鉴于miRNA参与动物毛发生成和皮肤毛囊发育及周期变化的调节和绵羊miRNA结构功能研究领域的相对薄弱，本研究拟对绵羊皮肤毛囊组织中的miRNA进行系统研究。从不同品种不同体表区的皮肤毛囊组织中构建miRNA文库，用生物信息学、深度测序技术和分子生物学相结合的方法筛选、分离、鉴定绵羊的新miRNA及其miRNA的靶基因，构建皮肤毛囊细胞发育及周期性变化的miRNA转录组信息谱，建立miRNA与蛋白编码基因共表达网络结构中的调控关系，解析特定miRNA在毛囊细胞发育及周期性变化过程中的调控功能。为毛囊细胞发育及周期性变化的miRNA调控机制积累基础资料，并为羊毛发生机理、羊毛性状的分子改良提供新的思路和有益的线索。

本研究利用高通量测序技术分别检测了藏绵羊处于生长期、衰退期和休止期三个时期的毛囊miRNA表达谱，通过生物信息学分析鉴定表达于毛囊的miRNA，并对miRNA-31、miRNA-205及miRNA-184进行了验证和靶基因的预测。取得的主要结果如下：.1.通过对3个不同发育时期的毛囊进行miRNA测序，总共检测到406个miRNA，其中5个为已知miRNA，其余401个为 绵羊基因组新发现miRNAs。在这401个miRNAs中，有320个与其他物种具有同源性，而其余86个为全新novel miRNA，研究结果进一步丰富了绵羊miRNA信息库。.2.通过对绵羊毛囊表达的miRNA在基因组中的分布研究，发现绵羊11号染色体的毛囊miRNA表达数目最多，因此推断绵羊11号染色体对毛囊发育有重要作用。.3.通过生物信息学分析，在3种毛囊中总计检测到102个时期间差异表达miRNAs，其中有44个miRNA为时期特异表达。3时期毛囊特异表达miRNA的数量分别为：生长期10个，衰退期27个，休止期7个。推断这些时期差异表达miRNA对毛囊生长周期具有重要调控作用。.4.通过QPCR检测发现miRNA-31在绵羊毛囊的生长发育中存在差异表达，其中在生长期高表达，而在衰退期低表达，呈逐渐下降的趋势。同时预测了miRNA-31的靶基因，发现KRT17与miRNA-31存在潜在的靶位点。通过QPCR验证，发现KRT17在毛囊3时期的表达趋势与miRNA-31相反，推测KRT17为miRNA-31的靶基因之一。.5.检测了miRNA-184及miRNA-205在毛囊3个发育时期及不同组织中的表达情况，进行了基因组定位及前体预测，并预测了可能的靶基因及调控的基因通路。结果发现miRNA-184的表达量从毛囊生长期到衰退期呈逐步上升的趋势而miRNA-205则表现为先上升后下降，其在衰退期毛囊表达量最高。两个microRNA在绵羊的多个组织中均有表达，两者的候选靶基因涉及15个基因通路，可能通过Wnt通路调控毛囊的生长周期。.6.通过绵羊皮肤和耳的组织切片，发现藏羊胚胎期皮肤以初级毛囊为主，次级毛囊较少，而成年羊以次级毛囊为主，初级毛囊较少；西藏羊的三毛囊群仅占23%；毛囊密度方面，成年羊的毛囊比胚胎期的稀疏；S/P比例为2.55，从这些研究结果说明西藏羊属粗毛羊品种。