肺腺癌组织细胞线粒体差异表达蛋白质的鉴定及功能研究

肺腺癌发病机制不明。线粒体在多种肿瘤发生、发展过程中起重要作用。目前，关于肺腺癌组织细胞线粒体蛋白质组学研究尚未见报道。本课题应用激光捕获显微切割技术纯化肺腺癌及配对的正常支气管肺泡上皮细胞（已完成）；应用差速离心结合percoll密度梯度离心获得各组织细胞线粒体；应用同位素标记相对与绝对定量技术标记肺癌组及正常组蛋白/肽；应用二维液相色谱-串联质谱结合生物信息学鉴定差异蛋白；应用免疫组化、RT-PCR分别检测（验证）肺腺癌组织差异蛋白及其mRNA；应用GFP进行差异蛋白定位（验证）；应用生物信息学方法结合酵母双杂交、串联亲和层析、RNA干扰技术及MTT法进行差异蛋白相互作用及功能研究。本课题首次应用亚细胞蛋白组学方法定量分析肺腺癌及配对的正常支气管肺泡上皮组织细胞线粒体差异表达蛋白质，并对差异蛋白进行定位、相互作用和功能分析，对探讨肺腺癌发生的分子机制具有重要价值。

肺癌是目前发病率及死亡率最高的恶性肿瘤，难以早期发现，预后极差，寻找新的肿瘤标志物及治疗靶点，揭示肺癌发生及发病机制，对肺癌治疗有着重要意义。本实验采用激光显微切割提取组织中目的细胞，通过细胞培养肺腺癌细胞株A549、小细胞肺癌细胞株NCI-H446和人正常支气管上皮细胞株16HBE，采用超高速差速离心的方法获取纯度相对较高的线粒体，运用iTRAQ标记联合2D-LC-MS/MS技术建立肺腺癌及正常肺组织细胞、 A549和16HBE及NCI-H446和16HBE线粒体差异蛋白谱，进一步筛选出和线粒体相关的差异蛋白。差异蛋白生物信息学分析结果表明：我们鉴定出了许多分子量极大、极小、极酸、极碱以及疏水性强的蛋白；差异蛋白参与了结合、催化、分子转导、运输和分子构成等生物学功能。PID信号通路富集分析发现和多条信号通路有关。从差异蛋白谱中筛选出肺癌相关蛋白，采用免疫组化的的方法验证，OAT在肺癌组织中的表达明显高于正常组织，FH及Rab GDIβ在正常肺组织中的阳性表达率明显高于肺癌组织。为一步寻找肺癌的治疗靶点，应用比较蛋白质组学方法分析盐酸埃克替尼作用前后人肺腺癌细胞系PC-9细胞相关蛋白的变化，建立差异蛋白谱，采用生物信息学方法初步鉴定了与埃克替尼作用机制密切相关的STMN1蛋白质，采用免疫组织化学方法检测STMN1在肺癌组织中的表达明显升高。应用RNAi 技术成功下调STMN1 基因，并证实抑制Stathmin 表达可导致PC-9细胞生物特性的变化。本研究结果表明iTRAQ结合 2D-LC-MS/MS技术是一项强有力的蛋白分离、鉴定技术，我们应用该技术鉴定了大量的肺癌和对照的差异表达蛋白，OAT、FH、Rab GDIβ及Stathmin的验证结果证实了我们蛋白组学结果的可靠性， OAT、Stathmin可能在肺癌的发生和发展中发挥重要作用有望成为肺癌的诊断标志物，OAT、FH、Rab GDIβ及Stathmin有望成为肺癌治疗的新靶点。