肺腺癌组织细胞膜差异表达蛋白的鉴定和功能研究

The pathogenesis of lung adenocarcinoma is unknown. Cellular membrane plays an important role during the tumor genesis and development. At present, the research of cellular membrane proteomics on lung adenocarcinoma has not been published. In this project，we will require lung adenocarcinoma cell and matched normal bronchioalveolar epithelium by LCM (new system). We will acquire cellular membrane proteins using sucrose density gradient centrifugation and mark lung cancer group and normal group proteins/peptides using iTRAQ. We will identify one or two differential proteins by liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS/MS) combined with GO, Bioinformatic, then detect lung adenocarcinoma differential proteins and mRNA in tissue and lung adenocarcinoma cell lines using immunohistochemistry, western-blot and RT-PCR respectively. We will confirm the location of differential proteins by KEGG and PID to define protein-protein interaction network. RNAi and MTT will be used to observe its effects on cell growth in vitro and in vivo. RNAi, Western-blot, RT-PCR will be used to investigate signaling pathway and its function of differential proteins .This project aims to provide useful ideal for elucidating the molecular mechanisms of the occurrence of lung adenocarcinoma and acquire potential early diagnosis markers of lung adenocarcinoma.

肺腺癌发病机制不明。细胞膜在肿瘤发生、发展过程中起重要作用。迄今，关于肺腺癌组织细胞膜蛋白质组学的研究尚未见报道。本课题拟应用激光捕获显微切割方法纯化肺腺癌及配对的正常肺组织细胞； 应用蔗糖梯度密度离心方法获得肺腺癌细胞膜，提取细胞膜蛋白质 应用iTRAQ分别标记肺癌组及正常组蛋白/肽；应用LC-MS/MS鉴定差异蛋白；结合文献及UniProt KB (http://www.uniprot.org/)数据库以及GO注释查询，应用生物信息学方法筛选（旨发现和肿瘤发生、发展密切相关的蛋白质）其中表达差异＞1.5倍的功能不明的1-2种蛋白质进行研究；应用免疫组化、Western-blot、RT-PCR分别检测（验证）肺腺癌组织以及肺腺癌细胞系上述蛋白及其mRNA水平并结合临床资料进行分析，以其找到肺癌的病理标记物；选取前期验证的意义比较大的蛋白，然后应用RNAi技术及MTT法等进行目标蛋白功能的初步研究； 结合KEGG及PID信号通路数据库，应用RNAi技术、Western-blot、RT-PCR法进行目标蛋白信号传导通路研究。旨在阐明肺腺癌发病分子机制、获得有价值的肺癌早期诊断标志物。

肺癌是目前全球最常见的恶性肿瘤之一，死亡率位居癌症相关死亡第一位。肺腺癌是肺癌最常见的病理类型，寻找可能的肺癌肿瘤标记物以及治疗靶点，揭示肺癌发生、发展分子机制，有着重要意义。本研究中，我们采用手工显微切割的方法纯化目的细胞，超高速差速离心的方法获取纯度相对较高的细胞膜；运用iTRAQ 标记联合2D- LC-MS/MS 技术鉴定了肺腺癌和正常肺组织的细胞膜蛋白表达谱；选取差异在1.5倍以上的蛋白作为差异表达蛋白；共鉴定了216个细胞膜及其相关蛋白。差异蛋白生物信息学分析结果表明我们鉴定出了许多分子量极大、极小、极酸、极碱以及疏水性强的蛋白；差异蛋白参与了结合、催化、分子转导、运输和分子构成等生物学功能。PID信号通路富集分析发现35 条信号通路富集明显，而KEGG信号通路富集分析发现19条信号通路富集明显，提示差异表达蛋白可能通过这些信号通路参与了肺腺癌的发生、发展。选取2个表达上调的差异蛋白S100A14及adipophilin进一步进行研究，采用Western blotting和免疫组化方法检测了其在肺癌中的表达结果提示：S100A14在肺腺癌组织中表达明显高于正常肺组织，其在G1+G2级肺癌中表达明显高于G3级肺癌； adipophilin在肺腺癌表达高于肺鳞癌。建立A549细胞adipophilin -shRNA慢病毒载体，流式细胞仪检测干扰后A549细胞凋亡增加，adipophilin可能与肺癌细胞凋亡有关，进一步需要对adipophilin参与肺癌凋亡的机制进行研究。MTT法检测干扰后细胞增殖抑制增加。研究结果提示： iTRAQ结合 2D-LC-MS/MS技术是一项强有力的蛋白分离、鉴定技术。S100A14可能在肺癌细胞分化中起到一定作用，adipophilin蛋白有希望成为鉴别肺腺癌和鳞癌的肿瘤标记物，且可能与肺癌细胞凋亡有关。本研究为我们鉴定肺腺癌和正常肺组织差异膜蛋白表达谱以及进一步寻找肺腺癌的肿瘤标记物、筛选治疗靶点、揭示肺腺癌发病机制提供了一定的理论基础。. 课题组按时完成实验，获得预期结果，培养博士及硕士研究生各1名，并发表SCI论文2篇，参加全国学术会议1次。