ZBED3：一个功能未知的母源蛋白影响早期胚胎发育的机制研究

ZBED3 is a oocyte-specific maternal protein which is screened from the mouse oocyte protein expression profil and is highly conserved between human and mouse.It is still lack of clear functional coverage in early embryonic development. ZBED3 mRNA is highly expressed in mouse zygotes and two-cell embryos, and the expression level of ZBED3 was significantly reduced in arrest two-cell embryos.The results of the preliminary study revealed that interference ZBED3 expression in zygote will induce most of the embryos blocking in 2-cell stage and reduce intracellular β-catenin levels.The results of pull down and Co-IP analysis also indicated that ZBED3 could interact with Axin2( key protein which can regulate Wnt / β-catenin signaling pathway ).And the expression profile of Axin2 in early embryo development is similar with that of ZBED3. All the results indicated that ZBED3 can regulte Wnt/β-catenin signaling pathway in the process of early embryonic development through interating Axin2. This study intends to apply overexpression、silent strategy and save test to verify that ZBED3 is involved in the early embryonic development by regulating Wnt / β-catenin signaling pathway from pros and cons sides.And we further domonstrate that ZBED3 is exercised its function through interation with Axin2 by mutation ZBED3-Axin2 binding sites. The research has a source of innovative, and will help to clarify the natrue of the protein function and the possible mechanisms involved in early embryonic development, thus contributing to reducing early embryonic development block and improving the success rate of IVF.

ZBED3是我们前期筛选到的卵细胞特异表达的母源蛋白，人鼠间高度保守，但目前尚无其在胚胎早期发育中功能与机制的研究。前期发现，ZBED3高表达于小鼠合子、2细胞期胚胎，2细胞发育阻滞胚胎中ZBED3表达显著下调；合子中ZBED3表达沉默可致胚胎阻滞于2细胞期且胞内β-catenin水平降低；Pull down和Co-IP分析发现Axin2(调控β-catenin)是ZBED3结合蛋白，Axin2在小鼠合子、2细胞期胚胎的表达与ZBED3基本一致。提示ZBED3可能通过与Axin2相互作用，影响Wnt/β-catenin信号通路，在早期胚胎发育中发挥作用。研究拟应用过表达、沉默策略及挽救试验，从正反两面论证ZBED3的生物学功能，通过突变ZBED3或Axin2结合位点论证ZBED3通过Axin2行使其功能的机制。研究将有助于阐明该蛋白的功能及机制，利于降低早期胚胎发育阻滞、提高IVF成功率。

胚胎着床依赖于胚胎植入能力的获得、母体子宫容受性的建立以及着床过程中母-胎信号交互等方面，这些过程涉及许多基因的共同作用，任何一个基因的异常均可能引起胚胎植入失败。对这些基因的研究，有利于寻找胚胎着床率低下的原因和为提高临床妊娠率提供理论依据。本研究将从遗传学角度出发，探索ZBED3蛋白缺失对小鼠胚胎植入的影响。RT-PCR显示ZBED3在小鼠卵巢和子宫组织中有表达，提示ZBED3可能参与卵子发生、早期胚胎发育及胚胎植入过程。我们构建了敲除小鼠（Zbed3-/-）研究其功能，Zbed3-/-雄性生育力正常，雌性生育力较野生型（WT）下降了50%。为了探究子代缺失的具体阶段，我们观察了孕11.5d和7.5d的胚胎，结果显示Zbed3-/-和WT胚胎植入点无差异，但Zbed3-/-蜕膜内胚胎数减少50%左右，即约50%胚胎发育停滞。由于ZBED3在子宫有表达，我们对孕3.5d-5.5d雌鼠子宫切片染色，观察子宫形态与β-catenin表达变化，结果显示WT与Zbed3-/-组子宫形态无明显差异，β-catenin定位及表达无明显异常，提示胚胎发育停滞并非子宫方面因素所致。随后，我们观察卵子与早期胚胎发育情况，观察GV体外卵母细胞成熟过程发现Zbed3-/- MII形成率较WT下降约16%；收集WT与Zbed3-/-合子经过体外培养至囊胚，结果显示两组二细胞率、四细胞率及囊胚形成率均无明显差异，继续培养发现Zbed3-/-囊胚孵出率下降。为了探索ZBED3影响囊胚孵出的机制，我们收集WT孵出囊胚与Zbed3-/-未孵出囊胚进行单细胞转录组测序，结果发现：Zbed3-/-中有1099个基因表达下调，1204个基因表达上调，差异基因涉及细胞代谢、细胞骨架、线粒体氧化磷酸化、细胞凋亡等过程，这些过程均与胚胎发育息息相关。文献检索Sparc、Id3、Lamc1、Flna、Slc7as等与胚胎植入有关，这些基因表达下降，将引起胚胎植入失败。另外，已知胚胎处于氧化应激状态将促使早期胚胎发育阻滞，我们发现ROS、载氧（或脂）、线粒体功能、转录翻译、凋亡相关基因在Zbed3-/-囊胚中表达下调，提示ZBED3缺失引起胚胎内氧化应激反应从而导致胚胎植入异常。综上，我们认为ZBED3缺失后，胚胎处于氧化应激状态，线粒体功能异常，细胞内核酸和蛋白质氧化增加，触发细胞凋亡，从而导致胚胎植入失败。