P450脂肪酸脱羧酶的定向进化及催化机理研究

Renewable hydrocarbon biofuels represent ideal alternatives for traditional fossil fuels due to their highest similarity to the petroleum-derived fuels in chemical structures and properties. The P450 fatty acid decarboxylase OleTJE identified from Jeotgalicoccus sp. ATCC 8456 is able to catalyze one-step decarboxylation reaction of fatty acids to terminal olefins, representing the most simple and direct biosynthetic pathway of bio-hydrocarbons. However, apart from the main decarboxylation reaction, OleTJE also catalyzes the α- and β-hydroxylation as side reactions. It appears that there is a correlation between OleTJE reaction modes (decarboxylation vs hydroxylation) and the carbon-chain length of its fatty acid substrates. The detailed catalytic mechanism of OleTJE and the molecular determinants steering this enzyme towards alkene production have not yet been defined. This project is proposed to first utilize an innovative directed evolution strategy to screen for mutant variants with improved decarboxylation activities specifically towards different chain length fatty acids. Meanwhile, the P450 reactivity to mechanistic probe substrates and site-directed saturation mutagenesis of key amino acid residues of OleTJE will also be investigated. Analysis of structure-function relationship of these mutants will provide us with significant insights into the elucidation of the enzyme’s unique catalytic mechanism, and into the understanding of the molecular modulation of OleTJE reaction pathways by the fatty acid substrate chain length and their spatial positioning at the active site. Finally, this project is expected to generate a series of OleTJE mutants with higher alkene-producing efficiency towards a wider range of fatty acids with different carbon-chain length. These mutant enzymes could serve as useful biocatalyst candidates for future microbial biosynthesis of alkene-based biofuels.

可再生性脂肪烃类生物燃料是传统化石燃料的理想替代品。来自咸海鲜球菌ATCC 8456菌株的P450脂肪酸脱羧酶OleTJE能够通过一步脱羧反应将脂肪酸转化为末端烯烃，是最简单直接的脂肪烃生物合成途径。然而，OleTJE催化底物氧化脱羧的同时也产生少量羟基脂肪酸副产物；并且随着底物脂肪酸碳链长度的变化，其催化效率和反应模式（脱羧或羟化）选择也随之改变。为深入理解OleTJE独特的催化机理和反应模式调控机制（即：底物链长-活性位点空间定位-反应模式选择之间的关系），我们拟采用创新性分子定向进化方法筛选针对不同链长底物活力提高的突变酶，同时结合对关键氨基酸位点的饱和突变和P450酶对机理探针底物的反应性，系统分析代表性突变体的结构—功能关系，揭示OleTJE脱羧活性的决定因素。本项目预期产生一系列针对不同链长脂肪酸脱羧产烃效率提升的突变酶，为将来在生物体内生产脂肪烯烃类生物燃料提供重要候选资源。

P450脂肪酸脱羧酶OleTJE能够利用H2O2为唯一电子和氧供体催化脂肪酸一步脱羧生成末端烯烃，是最简单直接的脂肪烃生物合成途径，备受学术界和工业界广泛关注。然而，OleTJE在催化脂肪酸脱羧形成末端烯烃的同时也产生少量羟基化脂肪酸副产物，并且随底物脂肪酸碳链长度的变化，其催化效率和反应模式（脱羧或羟化）选择也有所改变。. 为深入理解OleTJE独特的脱羧反应机理和反应模式调控机制，本项目首先通过创制过氧化物酶缺陷型E. coli宿主菌首次设计并构建了以H2O2-消耗为指标的96-孔板高通量筛选方法，解决了限制该类酶高通量改造筛选的根本问题。在此基础上，综合运用基因挖掘、定向进化和理性设计策略，筛选近一万个突变体克隆，获得针对不同链长脂肪酸底物（C8,C12,C16）脱羧活性或羟基化活性较亲本酶特异性提升的新型P450脂肪酸衍生酶元件10余个。并对它们的催化活性，底物偏好性，产物分布以及动力学参数进行了表征；结合对突变酶序列和三维结构的比对分析，以及催化机理探针底物的反应性和产物分布分析，明确了影响不同链长底物结合与定位的关键氨基酸残基位点信息，以及调控该类酶位点特异性和反应模式选择性的分子基础。我们的研究表明，OleTJE的化学反应选择性受底物链长、立体结构、大小，以及在活性中心的精确定位调控，底物Cβ位夺H是脱羧的前提条件，要求紧密的底物结合和较低的底物运动性，结合OleTJE产物分布分析，脱羧途径更偏向于通过Cβ位形成碳正离子的反应机制。. 此外，本项目还通过构建辅因子H2O2原位再生的新型酶促级联反应，实现了一锅法从低成本甘油三酯和天然油脂中高效生产α-烯烃（0.53g/L），为将来的工业化应用提供参考。. 上述研究结果有力推动了P450 脂肪酸脱羧酶家族的基础研究，并为其进入生物能源和生物材料领域的实际应用奠定了重要的理论和实验基础。项目执行期内已发表SCI 论文4 篇，相关成果申请国际PCT发明专利3 项，已获美国专利授权1项。并促生了两项国内外合作交流项目的资助。