菌毛pilA基因在血清5型副猪嗜血杆菌致病性中的作用

副猪嗜血杆菌（HPS）是近年来造成猪场严重经济损失的重要继发病原之一，与HPS致病直接相关的毒力因子尚不清楚。有研究表明，在限铁条件下，血清5型HPS中与IV型菌毛（Tfp）pilA基因同源的基因表达上调。在某些巴氏杆菌科成员中，已证明Tfp是重要的毒力因子。PilA是不是区分不同血清型HPS毒力的一个重要因子、是否与血清5型HPS的致病性直接相关、是不是一个必要的毒力因子呢？针对以上问题，本项目拟通过对15个血清型HPS的pilA基因进行扩增和序列分析，利用Red同源重组和自杀质粒同源重组技术构建5型HPS pilA缺失突变株，在突变株中导入PilA表达质粒构建互补株，电镜观察突变前后的菌毛特征、突变前后5型HPS对新生猪气管上皮细胞的毒力、对仔猪的致病力等进行检测，探索pilA基因在5型HPS致病性中的作用，为进一步探讨HPS的致病机制以及研制特异的诊断试剂、药物和疫苗奠定基础。

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）是引起猪格氏病的病原，多继发感染引起全身性疾病，其高发病率和死亡率给养殖业造成严重损失。普遍认为菌毛具有粘附、抽搐蠕动、调节生物膜结构、DNA摄取和交换等生物学功能。但是目前对副猪嗜血杆菌的菌毛在致病性方面功能的研究尚处于探索阶段，本文对副猪嗜血杆菌的菌毛基因进行克隆、表达以及构建基因突变株：.1.以副猪嗜血杆菌血清型1、2、5、7和9型基因组为模板扩增菌毛基因簇pilABCD，对15株副猪嗜血杆菌参考菌pilA基因进行克隆测序，结果表明pilA基因同源性为87.7%～100%，属于Ⅳa型菌毛。.2.将副猪嗜血杆菌血清型1、2、5、9型pilA基因扩增、克隆到原核表达载体pET-30b(+)中进行诱导表达，SDS-PAGE分析表明其以包涵体形式表达，蛋白大小约为15kDa。将5型重组pilA蛋白纯化后免疫Balb/c小鼠，制备多克隆抗体，用于对15株参考菌株进行Western-blot检测，结果未出现特异性条带，提示其在传代培养条件下不表达pilA蛋白。.3.以副猪嗜血杆菌5型为亲本菌，利用自杀载体pEMOC2构建pilA基因缺失重组质粒pEMOC2-△pilA，转入E.coliβ2155复制，应用细菌接合转移法将其导入到副猪嗜血杆菌受体菌。鉴定结果显示阳性接合子在第二次同源重组后回复到野生型的概率远大于获得突变株的概率，且PCR鉴定为阳性的接合子不能传代或经传代后又回复到野生型，具有不稳定性。.综上所述，本研究成功克隆、表达了pilA基因，证明15株参考菌中该基因同源性高且在体外均不表达pilA蛋白；利用自杀载体pEMOC2构建基因缺失突变株传代后易回复到野生型。