乙酰化蛋白DLA1调控番茄对灰霉菌抗性反应的分子机制研究

Grey mould caused by Botrytis cinerea is one of the most destructive diseases of tomato. Control of this disease has become a challenge due to fungicide resistance, thus, it is necessary to look for other effective approaches. Protein lysine acetylation is a reversible and dynamic post-translational modification, which plays an important role in regulating diverse cellular processes. Although protein lysine acetylation in plants is poorly studied compared to other higher organisms, there is increasing evidence that it is closely related to plant resistance to pathogens. In our previous analysis of Lycopersicum solanum acetylome, 589 acetylated proteins were identified, among which the acetylation level of DLA1 decreased remarkably after infection by B. cinerea. Knock-out of DLA1 by CRISPR/Cas9 led to decreased resistance to B. cinerea infection, but the mechanism is unclear. Based on these results, we will further explore the biological functions of DLA1 as well as the molecular mechanisms of lysine acetylation of DLA1 in regulating tomato defense response. This study will not only help to uncover the role of protein lysine acetylation in plant defense response and mechanism of plant-microbe interactions, but also lay foundation for controlling plant diseases with transgenic approaches.

番茄灰霉病是农业生产上的主要病害之一。目前该病害最主要的防治手段是化学防治，但病原菌抗药性问题已使该病害的防治成为生产上的一大难题，因此寻找其它有效防治手段势在必行。蛋白乙酰化是一种重要的蛋白翻译后修饰方式，参与了几乎所有的生物学过程。虽然到目前为止植物蛋白乙酰化研究较少，但已有研究结果表明乙酰化修饰与植物抗病反应密切相关。项目组前期在番茄中鉴定到了589个乙酰化蛋白，发现灰霉菌侵染后一个功能未知蛋白DLA1的乙酰化水平显著下降。利用CRISPR/Cas9技术将DLA1基因敲除后，DLA1突变体对灰霉菌的抗性明显降低，但其机制并不清楚。本申请项目将在前期工作基础上研究DLA1的生物学功能，阐明该蛋白的乙酰化修饰调控番茄抗病性的分子机理。本研究的结果将有助于解析番茄-灰霉菌相互作用的分子机制，揭示蛋白乙酰化修饰在植物抗病反应中的作用，为人们通过转基因手段控制番茄灰霉病的发生奠定分子基础。

番茄是我国重要的经济作物，番茄灰霉病是番茄生产中的重要病害之一，它是由半知菌类葡萄孢属的灰葡萄孢引起的一种毁灭性的腐生型病害。赖氨酸乙酰化修饰是一种重要的蛋白翻译后修饰方式，在各种生物过程中起着重要作用，如调控蛋白质稳定性，参与细胞信号转导，基因表达与活化以及调节酶活性等。本研究首次对灰霉处理的番茄和水处理的番茄的蛋白质组进行了LC-MS/MS分析，共鉴定到589个蛋白中存在923个乙酰化位点。后续生物信息学分析表明，番茄乙酰化蛋白分布于细胞的各个组分，参与了次生代谢、转录、翻译等多个生命过程。 DLA1为包含Bet-V-1结构域的小分子蛋白，PR10家族蛋白均含有该结构域。LC-MS/MS分析表明DLA1蛋白在灰霉处理后乙酰化水平显著下调，qRT-PCR结果表明在灰霉处理后24小时内DLA1 mRNA水平迅速下降。利用CRISPR/Cas9 技术得到了该基因的敲除突变体pTX-DLA1，并获得过表达突变体DLA1-GFP。灰霉侵染后，与野生型植株相比，敲除突变体pTX-DLA1的病斑明显变小，表明乙酰化蛋白DLA1在灰霉菌侵染番茄的过程中可能发挥着重要作用。但是过表达突变体GFP-DLA1的病斑没有明显变化。为了进一步了解DLA1蛋白的生物学功能，通过酵母双杂交以及Co-IP技术寻找与其互作的蛋白，通过酵母双杂交共获得10个可能的互作蛋白，通过Co-IP鉴定到523个蛋白。其中酵母双杂和Co-IP均鉴定到HSP90-1。HSP90-1-MYC和DLA-GFP共注射烟草后Co-IP结果显示HSP90-1与DLA1蛋白间确实存在互作。将DLA1的乙酰化位点进行Q与R突变后，不影响DLA1与HSP90-1之间的互作。BiFC结果与Co-IP结果一致。Co-IP还鉴定到两个NB-LRR类R蛋白：R1A3和R1B23。BiFC结果表明R1A3和R1B23分别与DLA1和HSP90-1都有互作，猜测RLA3和RLB23是通过与HSP90-1和DLA1形成复合物起作用，进一步实验正在进行中。本项目通过研究DLA1的生物学功能，阐明乙酰化修饰在该蛋白对灰霉菌抗性反应中的作用。研究的结果有助于阐明番茄-灰菌相互作用的分子机制，揭示蛋白乙酰化修饰在番茄对灰霉菌抗性反应中的作用，从而为番茄灰霉病的防治提供新的思路。