蛋白乙酰化修饰对天蓝色链霉菌发育分化的调控机制研究

Lysine acetylation is a dynamic posttranslational modification that is known to play an important role in regulating gene transcription, protein stability and RNA splicing, which has been considered as an epigenetics existing in eukaryotes only. Nowadays, researches of acetylation were reported both in microorganism and archaea, representing an evolutionarily conserved mechanism of metabolic regulation. In our preliminary experiment, a highly abundant and dynamic acetylation affecting the cell differentiation was found in Streptomyces coelicolor. The project takes this typical strain as the research object, will further identifies the acetylated proteins in vitro and in vivo. By integrating western-blotting, phenotypic analyses, and the enzymatic determination, different protein acetylation levels corresponding to the cellular physiologies can be characterized. In all, our work will reveal the molecular mechanism of lysine acetylation that regulates the cell differentiation for S. coelicolor.

赖氨酸乙酰化参与基因转录、RNA剪接、蛋白稳定等多种细胞进程，是真核生物中十分重要的表观遗传学修饰。最近，越来越多的证据表明该修饰存在于从古菌到细菌，再到真核生物的几乎所有生命体中，是一种进化上保守的调控机制。本实验室前期工作发现乙酰化修饰能够显著影响天蓝色链霉菌的发育分化，其中，敲除乙酰转移酶基因Spat1之后突变株生长加快、产孢受到抑制，而敲除去乙酰化酶基因ScobB1之后，其发育分化的表型相反。利用抗体富集联合质谱分析的方法，我们鉴定得到了该模式菌中受乙酰化修饰的蛋白质组，其中就包括参与细胞发育分化的SsgA和ParA/ParB蛋白。本项目拟在前期工作的基础上，综合利用分子遗传学和生物化学手段，从体内和体外两个方面鉴定乙酰化修饰对SsgA和ParA/ParB蛋白功能的影响。进一步分析目标蛋白的修饰位点，回补查看相应的生长表型，最终揭示天蓝色链霉菌中乙酰化调控细胞发育分化的分子机制。

本结题报告分为两部分，第一部分解析了乙酰化调控天蓝色链霉菌染色体分离蛋白ParB的分子机制，第二部分揭示了细胞第二信使cAMP通过竞争性结合和促进乙酰化修饰两方面调控乙酰辅酶A合成酶的酶活。.赖氨酸乙酰化修饰是一种从原核生物到真核生物中保守存在的蛋白翻译后修饰现象，对多个重要的细胞进程具有调控作用。天蓝色链霉菌作为研究原核生物发育分化的模式菌株，我们发现乙酰化修饰对其染色体分离具有调控作用。我们在天蓝色链霉菌中鉴定到一个全新的乙酰化修饰受体蛋白ParB。进一步研究发现其183位的赖氨酸是主要乙酰化修饰位点，并且该位点的修饰受到乙酰化酶ScPat和去乙酰化酶ScCobB1的调控。乙酰化抑制ParB与类着丝点序列parS的结合，而去乙酰化增强ParB与parS的结合。模拟乙酰化修饰的蛋白ParBK183Q在体内无法形成染色体分离中重要的ParB-DNA复合体，导致天蓝色链霉菌染色体分离异常。而去乙酰化酶ScCobB1对保证染色体正常分离起到关键作用，敲除SccobB1基因后链霉菌染色体分离出现异常。总结体内和体外的结果，我们的研究揭示了乙酰化修饰通过影响ParB分离复合物的形成调控了天蓝色链霉菌的染色体分离，进而参与调节了细胞发育分化进程。.乙酰辅酶A合成酶ACS催化乙酸生成乙酰辅酶A，同时消耗ATP。已知在大肠杆菌中，ACS的活力受到两个层次上调控。首先，cAMP-CRP从转录水平上调控激活ACS；其次，在翻译后修饰水平上，Pat乙酰化ACS的K609位点并使其失活。在本研究中，我们发现沙门氏菌中的cAMP还能以与ATP竞争性结合的方式抑制ACS的酶活，KI为200μM。ACS-AMP复合晶体结构解析证明，cAMP直接结合到ACS的ATP/AMP binding口袋。不仅如此，我们还发现cAMP与ACS的结合会增强Pat对ACS的乙酰化，抑制CobB对ACS的去乙酰化作用。这种调控作用在AMP forming家族的蛋白丙酰辅酶A合成酶（PrpE）和长链脂肪酰辅酶A合成酶（FadD）上也被证实，说明cAMP参与此类蛋白的乙酰化调控具有普遍性。总的来说，本研究发现的细菌中保守的cAMP直接结合ACS并抑制其活力的调控方式丰富了对ACS调控的研究维度，拓宽了经典第二信使cAMP的研究广度。