灰霉菌对APs类杀菌剂抗性分子机制的研究

嘧啶胺类杀菌剂（APs）是生产上常用的防治灰霉病的主要药剂，已有研究表明该类药剂能抑制灰霉菌甲硫氨酸的合成，但具体作用机制尚不清楚。胱硫醚γ-合成酶（CGS）是甲硫氨酸代谢途径中一个重要酶，我们的前期试验发现，灰霉病菌经APs处理后，CGS基因表达量显著增加，部分抗性菌株CGS保守区域存在点突变，CGS基因缺失突变体致病力丧失、药物抗性明显下降。以上工作初步证实CGS可能是APs的靶标位点。因此，本项目通过将点突变CGS基因转入敏感菌株，分析点突变与APs抗性的关系；通过高水平表达CGS基因，分析基因表达水平与APs抗性的关系；通过体外表达CGS蛋白，测定APs对CGS酶活性的抑制作用；通过基因敲除和回补实验，明确CGS基因的生物学功能。预期研究结果将阐明APs作用机制和CGS基因生物学功能，为新药研制和APs抗性治理提供科学指导。

本研究围绕灰霉病致病菌灰葡萄孢（Botrytis cinerea）甲硫氨酸（Met）生物合成途径上重要酶胱硫醚γ-合成酶（Cystathionine γ-Synthase，CGS）基因进行研究，试图明确CGS在菌体生命活动中的重要作用，并进一步分析嘧啶胺类杀菌剂（anilinopyrimidines，APs）对CGS的作用机制，以此找到这类生产上十分有效的杀菌剂的作用靶点。首先，我们利用高通量二代测序技术测定APs处理灰霉菌后基因组转录表达谱的变化情况，分析药物对菌体的作用模式，发现脂肪酸代谢途径、过氧化物酶体途径等多个基因参与了药物作用的响应。随后，我们研究发现CGS是灰葡萄孢生命活动的重要功能基因，参与了灰霉病菌的致病、产孢、气生菌丝的生长等生命活动，该基因的缺失能导致灰葡萄孢对Met的营养缺陷。同时，我们对CGS上下游基因CBS和MS进行了研究，发现CBS和MS基因对菌体的生长、致病没有明显的影响，但能影响菌体的生长速度。此外，我们选择了赤霉菌（Fusarium graminearum）中的CGS进行功能研究，发现该基因突变体不能正常产孢，对甲硫氨酸表现为营养缺陷，并在以SO42-为唯一碳源的培养基上无法生长。致病性实验测定发现该突变体致病力下降，赤霉毒素DON产量明显下降，说明CGS基因可能参与DON合成，这也是导致突变体致病力下降的一个重要原因。上述研究都证实了CGS在两种致病菌生命活动中的重要作用。在对APs类杀菌剂抗性的研究中，我们发现灰霉病菌CGS缺失突变体对APs类杀菌剂变敏感，而赤霉菌则没有变化。但是由于没有获得CGS表达蛋白，所以没能从蛋白水平上验证CGS是否为APs类杀菌剂的靶标位点。