组氨酸标记固定化酶反应器的制备及在相关酶基因功能鉴定中的应用

Enzyme reactors are necessary in enzymatic reaction which have a high stability, and are reusable, conveniently coupled to HPLC and mass spectrometry. Compared to the rapid growth of trypsin immobilized enzyme reactors (IMERs) in proteomics, the IMERs used for catalyzing small biomolecules metabolism expand slowly. This project aimed to develop the histidine-tag IMER (His-tag IMER), which could achieve recombinant enzyme immobilization by the affinity binding between metal and his-tag diterpene synthase. Meanwhile, using the analyzing results of the catalysate, the biochemical function of the interrelated enzyme gene could be characterized. The main study content is as follows: The preparation of hist-tag IMER; the set up of 2D HPLC-MS analyzing platform; the development of high-performance analyzing method for biochemical function characterization of enzyme gene. Hist-tag IMER could retain most enzyme activity to improve the efficiency of enzymatic reaction, and has good points of high stability, regeneration and reversible adsorption, and it is also reusable, conveniently coupled to HPLC and MS online, achieving the catalyst reaction of small biomolecules under dynamic state. This project could provide a high performance and rapid online analyzing method of the catalysate from IMER, and has an important application value in the biochemical function characterization of interrelated enzyme gene.

酶催化反应需要稳定性高、可重复使用和易于与色谱质谱联用的酶反应器技术。相对于蛋白质组学中胰酶固定化酶反应器的快速发展，应用于催化生物小分子代谢的固定化酶反应器发展缓慢。本项目拟研究组氨酸标记的固定化酶反应器（His-tag IMER）技术，此技术使用六聚组氨酸标记的重组融合蛋白植物二萜合酶与金属螯合亲和的方式实现酶的固载，并对相关催化产物进行检测分析，进而确定相关酶基因的生化功能。主要研究内容有：制备组氨酸标记固定化酶反应器；搭建酶反应器催化产物的液质联用二维分析检测平台；建立植物二萜合酶基因活性功能高效的分析方法。His-tag IMER可最大程度保留酶的活性、提高酶解效率，具有稳定、可逆吸附、再生等优点，同时可与色谱质谱在线联用，在动态情况下实现小分子底物的催化反应。该项目的完成能够提供一种快速、在线、高效的酶催化产物分析检测方法，在相关酶基因的功能鉴定中具有重要应用价值。

快速准确地鉴定不同萜类合酶基因的功能是阐释萜类化合物生物合成途径的迫切需要。固定化酶反应器可重复使用、稳定性高、易于与色谱质谱联用，是实现上述需求的有力工具。本项目搭建了匀速稳压的注射泵毛细管处理系统，可实现自动化地对毛细管进行冲洗、材料填充、键合反应、样品分离等操作，在此基础上制备了新型组氨酸标记固定化酶反应器并搭建了酶反应器-质谱检测分析平台。所制备的酶反应器孔径属介孔，有利于酶分子的活性构象形成，可对纳克级别的靶分子实现精准最优催化，能快速准确地鉴定不同萜类合酶基因的功能，是阐释萜类化合物生物合成途径技术的有益发展。建立了快速提取检测植物组织中牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸的方法，采用三元混合溶剂体系可快速提取样品中的目标物，用时短（1分钟即可），此方法简单、易上手且采购成本低，可在提取目标化合物GGPP时最大程度地减少样品降解和损失，且采用的化合物分离及检测系统分离用时短、检测灵敏度低（可达0.1 ng/μL），10分钟即可给出化合物的分离色谱图及高分辨质量数，提高了样品检测通量，最大程度地保留了化合物本身的物理化学性质，减少了样品的降解和损失，能够更准确地阐述植物代谢物功能。该项目还实现了基于阀的级联色谱柱在线串联质谱系统平台的搭建，可将两种不同性质的色谱柱进行级联，建立在线二维液相色谱分离技术，并能够针对一个复杂样品中不同性质的化合物分别进行在线分离后，依次通过串联高分辨质谱进行检测分析，可根据需要更灵活更多元地整合不同性质的色谱柱，方便检测更多不同性质的化合物，使化合物检测数目增加20%以上，能够得到更多更全面地复杂样品中的化合物信息，可以更全面地了解植物机体功能。