金属有机骨架固定化酶微反应器及其在毛细管电泳在线酶分析中的应用

Enzyme assay is very important for the development of new drugs and clinical diagnosis. The technique of capillary electrophoresis (CE) integrated with immobilized enzyme reactor (IMER) has been frequently applied in online enzyme-related analysis. However, the traditional methods for IMER-CE enzyme assay have some defects, including poor stability and catalytic activity of enzymes, inferior reusability of IMER and limited immobilization capacity. In present study, metal-organic frameworks (MOFs), which have distinct advantages in the field of enzyme immobilization, will be introduced into the enzyme assay. By using Unc-51-like kinase 1 (ULK1), which is an important target in cancer therapy, and some other enzymes as the model enzymes, three kinds of MOFs-based IMERs with excellent performance are fabricated. On this basis of MOFs-IMERs, several novel methods for IMER-CE online enzyme assays can be established, which have some advantages such as good reproducibility, high sensitivity, large capacity for enzyme immobilization and superior reusability of IMERs. By using the established methods, Michaelis constant and enzyme inhibition kinetics are evaluated. Furthermore, the ULK1-inhibitory activity of the natural products extracts with anti-cancer potential are analyzed. The proposed novel support materials and construction strategy for CE-based IMERs will not only contribute to solving the problems exist in CE-based enzyme assay, but also can be used in the analysis of ULK1-targeted drugs.

酶分析对于疾病的临床诊断以及酶抑制剂类新药的开发等具有重要意义。基于固定化酶微反应器（IMER）的毛细管电泳（CE）在线酶分析是一类重要的酶分析方法。传统的IMER-CE方法存在一些缺点，包括固定化酶稳定性较弱、催化活性较低、酶负载量较小以及酶可重复利用性较差等。本项目拟将酶固定领域有显著优势的金属有机骨架（MOFs）材料引入到CE酶分析中，构建三类酶固定性能优异的MOFs-IMER。以癌症等疾病治疗的新兴药物靶点ULK1激酶等为分析对象，建立多种重现性好、灵敏度高、酶负载量较大、酶可重复利用的MOFs-IMER-CE酶分析新方法。利用其进行酶分析应用研究，包括测定ULK1激酶等的米氏常数、酶抑制动力学参数，并评价抗癌中药提取物的ULK1激酶抑制活性。本项目所构建的新型IMER载体材料和酶分析策略对解决当前CE酶分析中的问题具有重要意义，还能为ULK1靶点药物分析提供新的思路和手段。

本项目将酶固定性能优异的新型功能化金属有机骨架（MOFs）材料成功修饰在毛细管内壁上并构建了MOFs酶微反应器（IMER），进而将其与毛细管电泳（CE）技术整合，成功建立了多种高性能MOFs-IMER-CE酶分析新方法，并应用于酶反应动力学评价、酶抑制剂类复杂样品的精准检测等领域。该研究首先发展出多种可用于MOFs-IMERs固定的新型功能化聚多巴胺（PDA）涂层材料和修饰方法，包括硬脂胺修饰疏水功能化PDA涂层毛细管柱、奎宁或L-精氨酸改性手性功能化PDA涂层柱以及高温溶剂热辅助高效快速制备PDA涂层的新方法。其次，构建了多种基于MOFs高效固定客体荧光纳米材料的新方法，包括铕基MOFs封装甲酰胺碳点复合纳米材料（FA-CDs@Eu-MOFs）以及多级孔MOFs封装碲化镉量子点复合纳米材料（HP-UiO-66-NH2@CdTe QDs），并成功将其应用于复杂样品体系中微量生物标志物的高灵敏荧光检测。研制出多种可用于酶固定的高性能MOFs涂层毛细管柱，包括纳米多级孔MOFs（HP-UiO-66）涂层毛细管柱毛细管柱及固定化半胱氨酸诱导原位生长（ICISG）方法制备而成的多种功能化MOFs涂层柱。在此基础上，以UiO-66-NH2和HP-UiO-66-NH2为固定酶的载体材料，结合原位生长（ICISG）以及PDA辅助固定策略成功制备了高性能UiO-66-NH2-IMER和HP-UiO-66-NH2-IMER，进而建立了多种灵敏度高、重现性好、酶载量大的MOFs-IMER-CE酶分析新方法。证实了其在实际酶分析应用中的较强应用价值，并对MOFs影响酶催化活性的规律进行了研究，揭示了不同多孔性质MOFs载体影响酶活力和CE酶分析性能的机制。本项目构建的新型MOFs-IMER材料和方法对解决CE酶分析领域存在的关键科学问题具有重要意义，还有望为酶抑制剂类药物筛选、手性药物分离分析等提供有效的技术支持。