柑橘采后生防菌柠檬形克勒克酵母细胞凋亡的调控机理研究

本项目的提出来源于生产实践，目前我国柑橘贮藏保鲜存在的突出问题主要是化学杀菌剂的残留物，病菌对化学药剂容易产生抗药性等。尽管从大自然中筛选的柠檬形克勒克酵母能有效地避免化学药剂残留的问题，但因其存在逆境条件下抑菌效果差、酵母细胞数量偏少以及酵母孵育过程中产生的抑制其繁殖的有害物质等原因，限制了它的商业化应用。结合前期研究工作基础，本项目拟以柑橘采后生防菌柠檬形克勒克酵母为材料，利用形态学方法、Annexin V法、DNA片断化以及TUNEL法等细胞凋亡检测方法进行柑橘采后生防菌柠檬形克勒克酵母细胞凋亡研究，探索柠檬形克勒克酵母在逆境条件下（如低温、高浓度二氧化碳及乙酸等）有效抑制柑橘采后病害以及提高它的生物量等问题，对阐明酵母细胞凋亡调控途径与柑橘采后生防菌柠檬形克勒克酵母拮抗机理的关系有重要意义，为一种新型的、安全无毒的生物保鲜剂的应用推广奠定基础。

拮抗菌34-9是一株分离于柑橘果园、已被证明能很好地保护柑橘果实免受病原菌危害的柠檬形克勒克酵母。为将酵母34-9成功地开发成为一种商业化产品，我们从三个方面入手，分别探讨拮抗菌34-9在诱导剂存在条件下发生凋亡的情况以及菌体发酵和贮藏过程中的细胞形态和凋亡特性。.乙酸作为一种抗微生物防腐剂，20 mM浓度就能显著抑制拮抗菌34-9的繁殖，40 mM孵育3 h，培养物浓度几乎没有改变。通过凋亡死亡典型特征检测，我们确定中高浓度乙酸能诱导酵母34-9发生凋亡。40 及60 mM乙酸诱导细胞发生凋亡的典型变化包括：TUNEL呈阳性的DNA降解；磷脂酰丝氨酸（PS）外翻；DNA片段化形成不同于哺乳动物凋亡细胞ladder结构的大片段，同染色质高度有序降解相一致，且多形成SSBs且/或DSBs；ROS积累；长形线粒体裂解，形成无嵴的、膨胀肿大的小线粒体；细胞核均一化程度降低，核膜逐渐消散等。.拮抗菌34-9发酵初期即代谢葡萄糖生产大量乙醇，因此我们推断该酵母具有crabtree效应，即细胞在有氧环境下利用葡萄糖进行酒精发酵而非进行菌体生长。这也是为什么进行菌体制备时，即使给予充足的营养物质，其生物量也只能达到108/mL而很难继续提高的原因。此外，葡萄糖的抑制作用还体现在抑制细胞同化乙醇及乙酸，只有当培养基中葡萄糖耗尽，细胞才能利用乙醇、乙酸进行二次生长，而大量乙醇、乙酸的积累又影响酵母细胞的代谢活性。因此我们总结，在制备34-9菌体的过程中，葡萄糖的浓度不是越高越好，而应该考虑它在调节代谢流方面的特殊作用。单批发酵过程中，24及48 h处细胞凋亡死亡的比例均很少，推测此时培养基中代谢产物积累还没有达到启动细胞凋亡的浓度。对细胞提前进行酸适应训练，可降低乙酸的毒害作用，有效改善细胞存活率。.柑橘的贮藏环境极不利于酵母34-9的存活，贮藏初期即开始发生死亡。除此之外，酵母存活率低可能还跟没有病原菌存在有关，作为病原菌的天敌，拮抗菌可能需要病原菌为其生存提供保障。这或许就是生防菌34-9拮抗效力的要素之一。