转录因子CsbHLH3调控柑橘采后果实柠檬酸代谢的机制

Organic acid is one of the most important components for fruit flavor of fresh fruit. And it is also the substrate of respiration and energy metabolism, which directly affects the storage performance and shelf life. Based on our previously studies, we found that CsGABP can directly regulate citrate content in citrus fruit, and CsbHLH3 could interact with the promoter of CsGABP, but the precise regulatory mechanism need to be further uncover. This project intends to comparative analyze the expression of CsbHLH3 and content of citrate in low-acid Jinxiu ‘Bingtang’ orange which is a bud mutant of ‘Bingtang’ orange and the control high-acid Qianyang ‘Bingtang’ orange during postharvest storage; Overexpression of CsbHLH3 in tomato and citrus callus, and interference expression of this gene in citrus callus to investigate the regulation functions of this gene in citrate metabolism. Additionally, we using ChIP-seq and EMSA method to further confirm the target genes downstream, and to clarify the influences and regulation mechanism of this gene in citrate metabolism and quality keeping during postharvest storage of citrus fruit, which has important theoretical and practical significance for postharvest citrus production.

有机酸是构成鲜食水果风味品质的重要组分，也是呼吸和能量代谢的底物，影响着果实贮藏及货架期。前期研究中，申请人发现CsGABP直接调控柑橘果实柠檬酸水平，显示转录因子CsbHLH3与CsGABP可能存在互作，但精细的调控机制还需要进一步解析。本项目拟以冰糖橙的芽变品种低酸的锦秀冰糖橙及高酸的黔阳冰糖脐橙为对照，分析冰糖橙贮藏过程中CsbHLH3的表达与柠檬酸含量变化；并通过在番茄中超量表达和柑橘愈伤组织中超量表达和干涉CsbHLH3，解析其在柠檬酸代谢中的调控功能；通过ChIP-seq和EMSA技术，进一步确定CsbHLH3的靶基因，阐明CsbHLH3对柑橘果实贮藏期柠檬酸代谢和品质保持的影响及相关调控机制，对指导柑橘采后生产具有重要的理论及实践意义。

维持一定的有机酸含量是湖南冰糖橙产业采后生物学研究中迫切需要解决的问题。研究有机酸的代谢及其调控对维持冰糖橙采后贮藏品质及提高其贮藏性能和经济价值具有重要的指导意义。前期研究表明转录因子bHLH很可能参与调控柠檬酸代谢，但具体调控机制尚不清楚。. 本项目以湖南冰糖橙及其高酸和低酸芽变品种为材料，探明决定高酸芽变品种果实高酸积累的原因；并进一步以CsbHLH003和CsbHLH085为研究对象，解析其基因功能及调控机制；利用血橙果实进行不同采后处理，筛选影响柑橘果实品质的最佳技术方案。. 研究结果表明，PH8、APD2、bHLH063和bHLH085的高表达均是黔阳冰糖脐橙高酸积累的主要原因，且其具有最好的贮藏性能。而bHLH003在高酸和低酸冰糖橙中表达无差异，其可能通过其他机制参与柠檬酸代谢。通过对CsbHLH003基因功能分析表明，该蛋白定位在细胞核中；番茄中超表达该基因，可通过下调柠檬酸合成相关基因PEPC1和PEPC2表达，上调柠檬酸降解相关基因ACO3a、ACO3b、GAD3、GDH和SSADH的表达，以及上调质子泵PH8的表达，综合减少柠檬酸的积累。相反，柑橘叶片中瞬时干涉该基因表达，可通过下调柠檬酸降解相关基因ACO2、ACLα1、ACLα2和GABP的表达，下调质子泵PH8、VHP2和VHP3的表达，综合提升柠檬酸的积累。进一步利用EMSA和双荧光素酶实验证实了CsbHLH003可以靶定PH8，且正调控其表达，与定量结果吻合。综合结果表明CsbHLH003是通过影响柠檬酸代谢路径多个基因表达水平综合负调控柠檬酸的积累。此外，我们还分析了bHLH其他成员CsbHLH085基因参与柠檬酸代谢的功能及机制解析，初步结果表明CsbHLH085可通过PIN途径正调控正调控柠檬酸的积累，同时该基因异常表达还能引起苯丙烷和激素代谢通路，具体机制还需要更多试验证据支持。血橙果实的采后处理初步结果表明处理T2、T8、T9和T13果实花青苷积累较早且较多，而处理T1、T3、T4、T6、T12和T14果实花青苷积累较晚且较少，还需进一步解析处理下影响品质的机制。该研究结果可以为寻找调控柑橘果实品质方法提供理论指导。