鞘脂菌CAP-1降解氯霉素的途径与分子机制

The ecological safety problem caused by environmental exposure of antibiotics residues and the spread of antibiotic resistance genes (ARGs) has increasingly become a prominent issue, posing a huge threat to human health and environmental security. Chloramphenicol (CAP) is an antibiotic frequently detected in various environments. Microorganisms are the main drivers of CAP degradation/transformation in the environment, however, the corresponding molecular mechanisms and metabolic related biomarkers are poorly understood. In this project, we aim to clone the genes/gene clusters invovled in the CAP complete degradation in an high-efficient CAP-mineralizing strain, Sphingobium sp. CAP-1, which was isolated from an activated sludge by the applicants, by whole genome sequencing, comparative proteome analysis in combination with classic molecular genetic protocols. We also plan to identify the physiological functions of key metabolic genes, purify and characterize the metabolic enzymes using functional genes knockout, gene element complementation, and in vitro overexpression techniques. The ultimate goals of this project are to 1) elucidate the complete metabolic pathway and molecular mechanism of aerobic bacterial mineralization of CAP, 2) enrich the fundamental theory of bacterial metabolism of antibiotics, 3) provide novel molecular ecological markers of microbial-mediated CAP fate, transformation activity and resistance risk assessment in the practical environments, and theoretical foundation toward a better bioremediation of representative CAP contaminated environments.

抗生素残留、环境暴露以及抗性基因蔓延导致的生态安全问题日渐突出，对人类健康和环境安全构成了巨大威胁。氯霉素是环境中普遍检出的一种抗生素类污染物，微生物是介导其降解转化的主要驱动者，但分子机制不清，指征代谢活性的分子标记匮乏。本项目将以申请者从活性污泥中分离获得的氯霉素高效降解矿化菌Sphingobium sp. CAP-1作为研究对象，采用全基因测序、比较蛋白质组学分析结合分子生物学等成熟手段克隆获得氯霉素降解上下游途径基因簇；结合功能基因敲除与回补和体外表达等方法鉴定氯霉素降解初始及代谢关键基因的生理学功能；纯化降解途径中的关键酶，并进行酶学特性研究。本项目将从分子水平上阐明细菌好氧降解矿化氯霉素的完整代谢途径与机理，丰富细菌代谢抗生素的基础理论，为氯霉素在实际环境中微生物介导的归趋、转化活性和抗性风险评价提供新型分子生态标记，为典型污染环境的微生物强化处理提供高效降解菌资源和理论指导。

氯霉素（CAP）是环境中普遍检出的一种抗生素，微生物是介导其降解转化的主要驱动者，但分子机制不清，指征代谢活性的分子标记匮乏。针对这一关键科学问题，本项目以CAP为研究对象，重点聚焦于富集并分离筛选高效降解菌、解析CAP降解特征及中间代谢产物生成转化规律、克隆表征新型关键降解酶基因和揭示活性污泥细菌完全氧化分解代谢CAP新途径。通过项目实施，从活性污泥富集获得了CAP高效降解矿化菌群，并从中分离培养了菌胶团形成菌Sphingobium sp. CAP-1，能高效利用CAP作为唯一碳、氮和能源生长并高效降解；鉴定了CAP新型侧链C-3'氧化产物O-CAP和C-1'氧化产物对硝基苯甲醛（PNBD）；确定了参与PNBD分解代谢进入三羧酸（TCA）循环的全部功能基因（簇）、催化CAP转化为O-CAP/PNBD的关键氧化酶基因（cmO）和菌胶团形成与调控完整基因簇；克隆表征了负责催化CAP到O-CAP和PNBD的新氧化酶CmO，该酶与生化功能鉴定的葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶（GMC）家族氨基酸相似性为41.05%，与鞘脂单胞菌科细菌氧化酶氨基酸序列高度保守（相似性>98%），进一步生物信息学分析表明，CmO同源序列在多样的革兰氏阳性/阴性细菌中广泛存在，证明了氧化反应介导CAP类抗生素（CAP、甲砜霉素和叠氮氯霉素）失活的环境普适性。CmO催化反应最适条件为30℃和pH=7.4，酶动力学参数Km=70.36 ± 6.68 μM，kcat=140.28 ± 2.42 s-1，确定了氧化酶CmO与CAP结合的活性氨基酸位点（Ala344、Tyr380、Met474、Gly99和Asn518），明晰了氧化酶CmO催化分子机制；与CAP酰胺水解酶和硝基还原酶相比，CmO与CAP乙酰转移酶能赋予微生物更高水平的CAP耐药性。基于如上生物与化学结果，绘制了氧化反应介导的CAP细菌完全分解代谢新途径。CAP降解菌（群）获得为其污染环境微生物强化修复提供了重要的细菌资源与方法支撑；氧化酶CmO的发现为CAP类抗生素在实际环境中微生物介导的归趋、转化和抗性风险评估提供了新指示基因和理论基础。