中药复方肃毒星抗恩替卡韦耐药乙型肝炎病毒关键组分的辨识与作用机制研究

Entecavir (ETV) is the most commonly-used first-line drug for the treatment of chronic hepatitis B, but it has a high drug resistance rate in lamivudine-experienced patients. Current rescue therapies show limited efficacy and require long-term (even life-long-term) treatment to prevent HBV reactivation. We previously found that a traditional Chinese herb medicine formula Suduxing extracts could effectively inhibit the replication and antigen expression of ETV-resistant HBV in vitro. The current study is to identify the key active ingredients and compounds, and to clarify their functional mechanisms of the anti-ETV-resistant HBV. The study design is as follows. 1) To identify anti-HBV key active ingredients in Suduxing extracts using the component knock-out and knock-in screening technologies. The stable ETV-resistant HBV-replicating cell line HepG2.A64 (patented) previously-established by our group are used to evaluate the in vitro inhibitory effect on HBV activities. 2) To isolate the key compounds from the active ingredients by chromatographic-oriented separation methods, and to identify the structures of the active compounds. 3) To clarify the molecular mechanisms of key active ingredients with optimized combination against ETV-resistant HBV through transcriptomics-targeted metabolomics-network pharmacology association analysis. 4) To verify the in vivo inhibitory effect of the key active ingredients on drug-resistant HBV activities in a mouse model that we previously established with persistent infection of multiple-drug-resistant HBV mediated by adeno-associated virus. The study is of original innovation, and the applicant and research group have solid research foundation, with advantages in key technological resources. The results have great value for the management of resistant HBV infection.

恩替卡韦（ETV）是治疗慢性乙型肝炎最常用一线药物，但对我国大量拉米夫定经治患者耐药率高，现有药物挽救疗效有限且难停药。我们前期筛选发现中药复方“肃毒星”总提物可在体外有效抑制ETV耐药HBV复制和抗原表达，本研究拟辨识肃毒星关键活性组分、鉴定有效化合物并阐明其抗ETV耐药HBV作用机制。方案：1)以目标成分“敲出/敲入”技术，用课题组建立的ETV耐药HBV稳定复制细胞系HepG2.A64（获专利）辨识肃毒星抗耐药HBV的关键活性组分；2)通过色谱定向分离和优选抗耐药HBV的关键活性化合物，鉴定化合物结构；3)以转录组学-靶向代谢组学-网络药理学关联分析方法，阐明关键活性组分组合的抗耐药HBV作用机制；4)以前期创建的腺相关病毒介导多重耐药HBV慢性感染小鼠模型，验证关键活性组分组合对耐药HBV的体内抑制作用。本项目具有原创性和扎实基础，申报团队具技术资源优势，结果对耐药乙肝治疗意义突出。

临床上恩替卡韦（ETV）耐药乙型肝炎病毒（HBV）感染，给慢性乙型肝炎防治带来挑战。本研究拟在前期工作基础上，结合中药学、分子生物学、免疫学、系统生物学研究，明确复方中草药提取物肃毒星（SDX）及其主要活性组分的抗ETV耐药HBV作用及其机制。.研究主要取得以下发现：1.在HBV耐药复制细胞系HepG2.A64中完成8批次SDX抑制病毒实验，发现SDX不但能有效抑制HBV DNA、HBsAg和前基因组RNA，也能有效抑制细胞内共价闭合环状DNA（cccDNA）。在小鼠模型中发现SDX可显著抑制HBV DNA、HBsAg和HBcAg水平。2.明确了SDX通过上调或下调某些基因表达、活化多种免疫细胞亚群，参与其抗病毒机制。3.对SDX中25种潜在活性成分进行了鉴定分析，发现6种活性化合物（苦参碱、氧化苦参碱、绿原酸、槐果碱、黄芩素、汉黄芩素）对ETV耐药HBV具有较好抑制作用。4.发现SDX两个主要组分黄芩素和汉黄芩素联合应用对ETV耐药HBV cccDNA有抑制作用，且在最佳配比浓度下两者联合的抑制作用优于单独用药。5.发现含有类似组分黄芩苷的保肝护肝中草药复方舒肝宁在HBV复制细胞模型中可有效抑制ETV耐药HBV的复制，联合低浓度ETV或替诺福韦酯有显著协同抑制作用。上述发现对于开发应用中药及其活性组分治疗ETV耐药HBV感染具有重要意义。.发表学术论文13篇（其中4篇为第一标注），包括SCI论文4篇（项目负责人均为第一或共同第一作者），中文核心期刊论文9篇（项目负责人为共同通讯或第一或第二作者）；参加国内外学术交流8篇次（含大会发言3篇次）；联合培养研究生毕业3名；合作获得省部级科技进步成果奖2项。以本课题研究成果为重要前期工作基础，与全军中医药研究所肖小河所长合作成功申报2019年度国家自然基金重点课题（81930110，本人排名第二）。本项研究基本完成了课题任务书目标。