新型穿孔蛋白LPFP介导的可变淋巴细胞受体/补体依赖的细胞毒作用及机制研究

Lamprey, the primitive jawless vertebrate, uses variable lymphocyte receptor (VLR) as alternative adaptive immune system instead of Ig-based receptors used in jawed vertebrates. Our previous study has shown that lamprey possessed a distinctive complement pathway activated by VLR, resulting in target cells lysis and ultimate disruption of cell wall integrity. However, it remains unknown as to what key effector molecules may implement the lysis of target cells in the final step of the cytotoxicity. By means of transmission electron microscopy and protein mass spectrometry, a novel lamprey pore-forming protein (LPFP) with a pore-forming domain was identified on the surface of the target cells killed by lamprey antisera. The LPFP may be similar to C9 in function and acts as defensive weapons against exogenous pathogens or transformed tumor cells in lamprey. Our object is to identify the relationship between LPFP, VLR and complements, and to clarify its cytolytic mechanism against target cells, and search a clue of the origin and evolution of adaptive immune system in lamprey.

原始无颌脊椎动物七鳃鳗是研究适应性免疫系统起源和进化的理想模式动物，拥有一套不同于免疫球蛋白的特殊适应性免疫系统--可变淋巴细胞受体(variable lymphocyte receptor，VLR)。在前期研究中我们发现VLR可激活补体系统产生细胞毒作用，导致靶细胞强烈的杀伤效应。但其终末杀伤效应分子尚不清楚。通过透射电镜和质谱技术，我们在杀伤后的靶细胞膜上发现了一种新的穿孔蛋白LPFP。该蛋白有典型的穿孔结构域，其功能可能类似于穿孔素或补体膜攻击复合物，是七鳃鳗抵御外来微生物或体内异常突变细胞的强有力武器。本项目旨在探索LPFP在靶细胞表面形成穿孔蛋白复合物的分子机制；阐明该细胞毒作用中穿孔蛋白LPFP与VLR、补体分子间的相互协同作用；深入探讨LPFP介导的VLR/补体依赖的细胞毒作用机制。该研究为进一步研究适应性免疫系统的起源及进化提供线索。

七鳃鳗作为最原始的无颌类脊椎动物，是无脊椎动物向脊椎动物进化的过渡物种。补体在机体的免疫系统中充当了重要的角色，也是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁。在七鳃鳗体内也发现了类似补体介导的免疫反应，并且发现了多个补体分子，如C3、C1q、B因子（Bf）、MBL、MASP等。前期工作证实了七鳃鳗体内存在由VLR介导的补体激活途径，这条途径由VLR与C1q结合形成免疫复合物来激活，并通过C3的裂解激活下游终末途径，类似于高等脊椎动物补体系统中的经典途径。同时，我们发现了VLR可激活补体系统产生细胞毒作用，导致靶细胞强烈的杀伤效应。但其终末杀伤效应分子尚不清楚。本项目在前期通过透射电镜和质谱技术，发现在七鳃鳗体内存在一种全新的成孔蛋白（LPFP蛋白），但具有补体C9穿孔的表型和分子特征，但具体的分子机制尚不清楚。本项目完整地解析该分子，作为七鳃鳗体内独特的穿孔蛋白，它与上游VLR介导的补体激活途径完美地结合，在七鳃鳗补体分子C3、C1q、B因子（Bf）等系列分子的参与与协同作用下，形成了七鳃鳗独特的补体杀伤途径。至此，本团队在该国家自然基金的支持和资助下，我们首次发现在七鳃鳗这一古老模型动物体内，存在着一条独特的、独立于现有的三条补体激活-杀伤途径；并且系统阐明了这一独特的VLR-C1q在上游激活、LPFP穿孔蛋白在C3等补体系列催化后，行使最终的下游杀伤功能。由此，我们绘制了一条完整的新的补体激活-杀伤途径，并系统阐述了它的作用机制。LPFP介导的杀伤，比传统的补体杀伤，具有如下特点：1. 形成的穿孔孔径比C9形成的穿孔蛋白大；2.杀伤的效率高、杀伤时间短，对大肠杆菌等微生物和肿瘤细胞均有明显的强有力的杀伤作用；3.其杀伤过程中，有多个分子协同参与，非独立完成。用抗体去除血清中VLR或C3分子，均能抑制LPFP蛋白对HeLa细胞和大肠杆菌的杀伤作用。综上所述，本研究为补体系统进化及脊椎动物适应性免疫进化提供了新的理论依据。