茶树酯型儿茶素合成和代谢的分子机理

酯型儿茶素合成代谢基因的挖掘，是开发高含量酯型儿茶素茶树资源的基础。酯型儿茶素合成分子机理尚未明晰。我们前期工作取得实质性进展，首次从酶学角度证实了酯型儿茶素的合成和水解途径。本项目拟在前期工作基础上，利用蛋白质分离纯化、质谱鉴定等技术，对酯型儿茶素合成与水解相关酶UGGT、ECGT和GCH进行分离纯化，并分析其酶学和结构信息；采用功能克隆和同源克隆策略，从茶树转录组和基因组数据库中筛选与酶基因及其调节基因的候选EST和ORF序列；利用qRT-PCR技术研究候选基因的表达与儿茶素合成代谢的相关性，进一步确定与酯型儿茶素合成代谢相关的基因；克隆基因全长；通过原核表达、体内过量表达和RNAi干扰、酵母双杂交等技术，验证基因功能。本研究对于探明酯型儿茶素合成代谢的分子调控机制，并对我国茶树优质基因资源的挖掘，具有重要的理论意义和实际价值。

根据项目任务书中的研究内容，本项目开展了以下工作:①首先采用酶蛋白分离-纯化-蛋白质胶条MS/MS测序-转录组筛选的策略，从茶树和葡萄中获得了若干个ECGT和GCH 候选基因。②利用候选基因信息，依托课题组和依托单位已经构建的茶树基因组全长ORF数据库和转录组cDNA数据库，比对、筛选与酯型和非酯型儿茶素合成和水解相关的候选基因，并从中筛选到63个与茶树类黄酮合成相关的结构基因和73条MYB和49条bHLH转录因子基因，59条茶树SCPL基因和130条茶树UGT基因，大量的GCH 相关候选基因。③利用RACE技术，克隆了其中与茶树酚类物质合成相关的结构及调节基因(大多数基因正在进行功能分析，因此暂时没有登录)。④利用qRT-PCR和转录组测序、代谢组UPLC-3QMS/MS测试技术，系统研究了这些基因在茶树不同器官、叶片不同发育时期、环境因子诱导的表达模式与茶树酚类物质合成与积累的相关性，研究结果发现，茶树酚类物质的合成与积累具有组织器官和发育特异性,诱导表达特异性。⑤利用酸水解和硫解技术，结合RP-HPLC-TOF-MS、NP-HPLC 、UPLC-QQQ-MS/MS、MALDI-TOF-MS、13C-NMR, 和 1H-NMR分析鉴定技术，对茶树不同器官的缩合单宁PAs（聚合态儿茶素）进行了定性和定量研究。研究发现，茶树酚类物质的合成积累的确存在显著的组织器官特异性差异，即茶树叶片中是以游离的B环三羟基的没食子酰基化儿茶素合成积累为主，其中EGGT和F3’5’H酶是关键酶；而在根中则以聚合的B环二羟基的非没食子酰基化儿茶素合成积累为主，即主要积累聚合的儿茶素PA，在根中缺少EGGT和F3’5’H酶，推测存在涉及PA合成的儿茶素聚合酶类。⑥利用原核表达、酵母真核表达体系、烟草和拟南芥转基因体系，验证了绝大多数结构基因和相关转录因子的功能。本项目基本完成了项目任务书预定的研究内容，明确了酯型儿茶素合成代谢的分子调控机制，明确酯型儿茶素生物合成和水解的生化及分子机制。本项目达到了项目立项的研究目标。. 本项目实施过程中，培养博士后1名,博士3名,硕士6名。在国外期刊上发表7篇文章，国内期刊发表13篇，授权专利3项，正在申请专利5项。参加国际学术会议4次。