应用免疫组织化学法对云南茶树中酯型儿茶素亚细胞水平的定位研究

Galloylated catechins, as the main secondary metabolites in the tea plant, which comprise approximately three quarters of all tea plant catechins, have stronger effects than non-galloylated catechins, both on the product quality in tea processing and the pharmacological efficacy to human beings. Classical histochemical localization staining reagents do not specifically detect galloylated catechins; thus, their subcellular localization remains controversial. In this study, we generate anti-galloylated catechin monoclonal antibodies by monoclonal antibody (mAb) technique, evaluate the antibody’s specificity and affinity by ELISA and Bio-Layer Interferometry (BLI) technique, determine the galloylated catechins content of different tissues by HPLC technique in the tea plant of Yunnan and identify the optimal tissue for freezing microtomic sections, immunohistochemistry analysis to study the subcellular localization of galloylated catechins. Excuting this project is helpful for providing insights regarding the mechanisms of galloylated catechin biosynthesis, transport, storage, and physiological functions. Moreover, the subcellular localization of galloylated catechins in the tea plant as determined by immunohistochemical staining suggest a new way for the subcellular localization of secondary metabolites in plants.

作为茶树中的主要次级代谢产物，酯型儿茶素约占总茶儿茶素的75%，其对于茶叶加工产品品质的影响及人类健康的药理功效均高于非酯型儿茶素。由于普通的组织化学定位染色试剂不能特异性识别酯型儿茶素，所以茶树中酯型儿茶素的亚细胞定位一直存有争议。本项目拟利用单克隆抗体技术来制备抗酯型儿茶素单克隆抗体；利用直接ELISA法和生物膜干涉技术评价抗体特异性及亲和力；通过HPLC检测分析云南茶树不同组织中酯型儿茶素的含量，以选择合适的组织制作冷冻切片；并应用免疫组织化学法对茶树中酯型儿茶素进行亚细胞定位研究。此研究结果可为酯型儿茶素的生物合成、转运、储存机制以及其生理学功能研究提供了理论参考，同时为植物中的次级代谢产物进行亚细胞定位方法提供新的思路。

儿茶素是茶叶中重要的品质与功能成分，主要包括非酯型儿茶素和酯型儿茶素。酯型儿茶素主要由EGCG和ECG组成，其中EGCG具有显著功效而备受学者关注，关于富含酯型儿茶素的茶树品种资源筛选是近年来该领域研究的热点，目前对于酯型儿茶素的亚细胞定位研究甚少。基于此，本项目开展了以下5个方面的研究：1、制备了抗酯型儿茶素单克隆抗体和抗酯型儿茶素多克隆抗体，结果表明，两种抗体均可以与酯型儿茶素特异性相结合，具有等同的染色识别效果。2、对同一茶树不同组织部位、茶树的不同品种、不同地区来源的茶树的酯型儿茶素含量进行了测定，得出茶的嫩芽嫩叶中酯型儿茶素含量最高，不同品种、不同地区来源的茶树嫩叶酯型儿茶素含量差异性很大，呈现生态多样性的特点，其中酯型儿茶素含量最高的茶树组织为困鹿山群体种茶的嫩芽嫩叶。3、以云南特种名茶十里香为材料，对茶树的嫩芽进行空间组织定位研究，发现与酯型儿茶素合成相关的基因多在芽轴组织中表达。对十里香嫩芽、嫩芽叶绿体中的酯型儿茶素检测，发现嫩芽叶绿体中酯型儿茶素远少于嫩芽中的酯型儿茶素含量，推测酯型儿茶素有可能在其他亚细胞中累积。4、选用抗酯型儿茶素抗体在多种茶树嫩叶中进行酯型儿茶素定位研究，褐色、深褐色的物质均着色在圆形、椭圆形大小不一分散的液泡中；进一步选用抗酯型儿茶素抗体在两种茶叶中精准定位，发现在芽轴和中心叶脉附近，有多个圆形、椭圆形的液泡中有深色物质累积，因此，推测茶叶中的酯型儿茶素多累积在芽轴和中心叶脉附近的液泡中。5、茶叶酯型儿茶素中的EGCG化学产物具有很好的抗肿瘤，促进糖尿病伤口愈合等作用，具有广阔的应用前景。 此研究结果可为充分开发利用云南的茶资源提供理论依据。