苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒ODV-E25与宿主细胞的相互作用及其功能研究

杆状病毒病毒体被膜蛋白是病毒体首先接触宿主细胞并与之发生相互作用的结构组分，与病毒的侵染、致病毒力、细胞周期调控、病毒蛋白在细胞内的迁移、病毒体装配和释放密切相关。ODV-E25基因是鳞翅目昆虫杆状病毒的核心基因，ODV-E25是病毒体被膜的主要蛋白质之一，其功能尚未明了。苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（AcMNPV）是杆状病毒的代表种，多种重要农业害虫的自然控制因子；以AcMNPV为基础构建的杆状病毒表达载体广泛应用于各种活性蛋白质的制备和研究。 本项目拟构建AcMNPV odv-e25缺失和回补突变体，解析AcMNPV ODV-E25对BV和ODV复制的作用；研究ODV-E25与宿主细胞蛋白的相互作用及其生物学意义；分析ODV-E25在细胞内的动态分布，识别ODV-E25的主要功能域。对ODV-E25的功能解析将增进对杆状病毒复制机制的阐释，有可能为杆状病毒的基因操作和应用改良提供理论依据。

按照项目计划本课题组采用多种基因操作技术构建了苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV) odv-e25基因缺失突变体、odv-e25基因缺失-异位回复突变体、odv-e25基因序列插入或部分截除替换突变体、odv-e25基因早表达突变体和超表达突变体；通过用这些突变体对Sf9细胞的转染-感染实验，结合荧光标记、免疫荧光共聚焦显微分析、电子显微镜分析、定量PCR和免疫印迹和其它实验分析证实odv-e25是病毒复制必需基因；发现odv-e25基因早表达阻断ODV-E25蛋白入核和病毒形态发生,由此推测ODV-E25的入核运输存在严格的时程调控；发现odv-e25早表达下调晚期基因vp39启动子控制的报告基因表达；odv-e25缺失或早表达不影响病毒DNA复制；odv-e25基因缺失不影响晚期基因表达；odv-e25超表达对病毒增殖无明显影响；发现ODV-E25序列和结构完整性对病毒复制至关重要；ODV-E25 N-端45aa对其入核必不可少，其46-118aa区段影响其入核效率和核内定位；发现ODV-E25可能以二聚体或多聚体形式存在。我们构建了两个AcMNPV感染Sf9细胞的cDNA文库；通过酵母双杂交从Sf9细胞cDNA文库和AcMNPV感染Sf9细胞cDNA文库中筛查出8个可能与ODV-E25相互作用的Sf9细胞蛋白基因，通过免疫共沉淀分析证实了其中两种细胞蛋白与ODV-E25的相互作用，制备了ODV-E25以及两种宿主互作蛋白的多克隆抗体。目前，我们正在对ODV-E25与这两种宿主蛋白相互作用的生物学效应进行实验分析。