蓿银纹夜蛾核型多角体病毒感染破坏Sf9细胞核纤层的机制研究

At present, the details and the significance of lamina changes after baculovirus infection are unknown. Preliminary experiment showed that Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) infection leads to the changes of the distribution and amount of Lamin in the perinucleus of Sf9 cells. We propose that baculovirus could recruit the viral or cellular proteins to disrupt the lamina and promote the release of progeny virus capsids. This study focuses on the subtle changes of the distribution, integrity and stability of lamina during baculovirus infection by means of Immunofluorescence (IF), Western blotting and Immunoelectron microscopy (IEM). The viral genes related to the changes of lamina will be screened from AcMNPV genomic library. By knockout of the related baculovirus genes, their roles on the changes of lamina and the significance of lamina changes on the egress of capsids from nucleus will be determined by means of IF and IEM. These experiment results would detailedly explicit the changes of lamina after baculovirus infection and reveal the mechanism of lamina disruption. This proposal will shed new insights into the mechanism of the release of baculovirus capsids, and also provide new evidence for the genetic improvement of baculovirus insecticide.

目前对杆状病毒感染昆虫细胞后核纤层 (lamina) 的变化及其对子代病毒核衣壳释放的意义尚不清楚。预实验表明，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV) 感染Sf9细胞后核纤层蛋白 (Lamin) 在核周的分布与数量发生显著变化。推测杆状病毒利用病毒或细胞的蛋白打破核纤层以利于核衣壳向外释放。本项目拟通过免疫荧光、Western blotting、免疫电镜观察AcMNPV感染后Sf9细胞核纤层的分布、形态和稳定性的变化；从AcMNPV基因组文库筛选对核纤层性状存在直接影响的病毒基因，构建相关基因缺失的重组病毒，通过免疫荧光观察病毒DNA转染后核纤层的变化，同时通过免疫电镜观察核衣壳在核内外的分布与数量，分析核纤层变化对核衣壳释放的意义。本研究将明确杆状病毒感染昆虫细胞后核纤层的精细变化及其发生机制，为理解杆状病毒核衣壳的释放机理提供新的理论基础，为杆状病毒杀虫剂的遗传改良提供一定的依据。

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）是杆状病毒的模式种。其细胞感染过程包括吸附、内吞、入核、脱壳、复制、装配、出核、释放等。目前，对AcMNPV的核衣壳的出核机制尚不清楚。本项目从内核膜蛋白及附着在内核膜上的核纤层蛋白入手，研究了AcMNPV感染后内核膜蛋白lamin B 受体（LBR）及核纤层蛋白Dm0-like lamin的变化，为理解AcMNPV的出核机制提供一定的线索。经过3年探索，取得以下几个方面的重要成果：1）观察AcMNPV感染后核纤层的变化。在克隆了Sf9细胞核纤层蛋白基因Dm0-like lamin的基础上，分析了其序列特征。通过western blotting证明，AcMNPV感染后lamin的量明显减少，免疫荧光实验观察到病毒感染后lamin的荧光强度变弱且核纤层出现褶皱；电镜观察到病毒后内外核膜分离，核膜向细胞质伸出突起，子代病毒的核衣壳则移向该突起。2）为了观察杆状病毒感染后内核膜的变化，首次克隆了Sf9细胞内核膜蛋白 LBR的基因的开放阅读框（Orf）序列，构建了LBR和红色荧光蛋白基因融合表达的重组质粒。通过质粒转染-病毒感染、western blotting结果证实病毒感染能降解LBR。用蛋白激酶C（PKC）抑制剂处理细胞，LBR的降解受到抑制，而且子代病毒的滴度下降。3）此外，围绕研究主题，拓展了项目的研究内容，包括：①研究了另一类DNA病毒——伪狂犬病毒（PRV）感染对宿主细胞核纤层蛋白lamin A的影响，发现PRV感染能破坏lamin A；病毒的UL31和UL34蛋白共表达则可直接破坏lamin A。②对AcMNPV 的参与病毒基因组复制并与宿主范围相关的重要基因——p143 (helicase)的密码子偏好性进行了分析，结果表明p143的密码子偏好性较低，推测p143单独不足以病毒影响宿主范围，可能还需要其他因子参与，共同决定AcMNPV的宿主范围。