苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AC146蛋白在病毒粒子发生中的功能研究

Baculovirus was widely used in insecticide and gene expression vector. AcMNPV is a type species of Baculovirus research, and is also a type species of general virology research. Up to date, it is not clear to the assembly of AcMNPV virion. It is known that AC146 is localized in nucleocapsid of AcMNPV BV and ODV. Construction with AC146 deleted cannot get the virion, but its DNA replication is not affected and the empty Occlusion body is formed. This project is to research the function of AC146 in AcMNPV virion formation. By gene knockout and electron microscope technology, analyze the effect of AC146 knockout to virogenic stroma and nucleocapsid formation. Using EdU-Apollo® fluorescence and immuno gold staining,research AC146KO effect to virus DNA and VP39 localization. Using Western-blot, analyze whether the expression of other Nucleocapsid proteins were affected by AC146KO. With formaldehyde cross-linking, Co-Immunoprecipitation, Pull down and yeast two-hybrid technology, unclose the complex formed by AC146 and other nucleocapsid proteins, molecular interaction and localization. By Site-specific mutation, research the function of 34kDa AC146 with posttranslational modification in ODV formation. This project can illuminate the function of AC146 in AcMNPV nucleocapsid assembly. It will show great significance to baculovirus assembly mechanism research and insecticide development. Meanwhile, it can contribute some references to animal virus research.

AcMNPV是杆状病毒和普通病毒分子生物学研究的重要模式。目前杆状病毒粒子的形成机制仍不明了。已知AC146是AcMNPV BV和ODV衣壳成分，缺失后导致病毒粒子不能形成，但能合成病毒DNA和产生空包涵体。课题拟进一步研究AC146在病毒粒子形成中的功能。利用Ac-Bacmid系统构建AC146缺失和回复的病毒；利用电镜和EdU荧光，分析AC146缺失对病毒发生基质形成和衣壳发生的影响；通过Western-blot和胶体金电镜，研究AC146与其他衣壳蛋白表达和转运的关系；利用甲醛交联-免疫共沉淀、酵母双杂交和免疫电镜等，揭示AC146在病毒粒子上的蛋白复合体、互作分子和定位；利用定点突变，解析AC146翻译后修饰对ODV形成的意义。研究能够阐明AC146在病毒粒子发生中的功能，对揭示杆状病毒的组装机制具有重要意义，对新型病毒杀虫剂开发具有重要价值，对动物病毒的研究也具有重要的借鉴意义。

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)是昆虫杆状病毒研究的重要模式，本项目对AC146蛋白在AcMNPV病毒粒子衣壳组装中的功能进行了研究。利用Ac-Bacmid系统构建了AC146缺失和回复的病毒。利用重组病毒构建和电子显微镜技术，证明敲除AC146以后虽然产生包涵体，但是AcMNPV不能形成病毒粒子。基于Western-blot和质谱分析证明AC146不是AcMNPV的结构蛋白；通过免疫印迹和质谱分析证明AC146只有23KDa的分子质量形式，否定了国外学者的研究结果。构建了AC146的酵母诱饵载体和14个核衣壳相关蛋白的酵母捕获载体，通过酵母双杂交实验证明AC146与AC103、AC141两个蛋白之间存在分子互作。利用定点突变，构建了多个分别缺失了不同结构域的重组病毒，转染结果证明AC146蛋白序列中的各个结构域对其功能均是必需的。构建了仅起始密码子ATG突变的突变体，证明了AC146不是以顺式作用元件的功能起作用，而是以蛋白形式起作用。研究从一定层面解析了AC146与AcMNPV衣壳发生的关系，对揭示昆虫杆状病毒的复制与组装机制具有重要意义，为进一步的研究打下了坚实基础。