HNF4a调控慢加急肝衰竭(ACLF)患者祖细胞来源功能性肝再生的机制研究

In recent years, acute-on-chronic liver failure (ACLF) has been established as a distinct disease entity derived from patients with cirrhosis. ACLF patients have only 50% spontaneous survive reportedly, and the final clinical outcome depends on whether liver progenitor cells regenerate efficiently after parenchymal cell death. It was firstly claimed by our group that submassive hepatic necrosis(SMHN) with cirrhotic nodules is a critical histological feature of HBV-associated ACLF （2015 Journal of Hepatology）. And we have demonstrated that the transcription factor HNF4α in liver early growth has apparently expressed in spontaneous survive ACLF patients comparing with death or liver transplantation in the present study. Accordingly we come up with the hypothesis that HNF4α is the key transcription factor regulating liver regeneration after SMHN, and it may have following two kinds of directive functions in promoting regeneration: liver progenitor cells- hepatocytes polarization and liver progenitor cells- primitive ductual structure- mature bile duct. This research plans to establish HNF4α selectively gene knock out mice in hepatocytes and blie duct differentiation axis , aiming to explore the relationships among the HNF4α expression after directional blocking differentiation pathway from liver progenitor cell to hepatocytes and bile duct cells, hepatocytes polarization structure deficiency and bile ducts dysmaturity. Verificating the hypothesis has profound influence in understanding the mechanism of liver regeneration and discovering HNF4α as a new therapeutic target for patients to promote effectively liver regeneration and improve prognosis.

肝硬化基础上的慢加急性肝衰竭（ACLF）是近年来新发现的一类疾病，患者只有50%自然存活率，目前认为来源于肝祖细胞的再生是影响疾病预后重要因素。本人团队首先阐明了假小叶基础上发生亚大块坏死是HBV相关ACLF的重要病理特征，并发现肝脏早期发育核转录因子HNF4a在ACLF预后不良患者肝脏表达明显降低并存在其下游调控的功能性肝再生障碍。据此我们提出HNF4a是调控肝大块坏死后再生的关键转录因子，具有促进以下两类定向性功能肝再生作用的假说：祖细胞—肝细胞分化轴上的肝-毛细胆管结构单位形成以及祖细胞—胆管细胞分化轴上的成熟细胆管形成。本研究拟通过分别建立肝细胞及胆管分化轴上的选择性HNF4a基因敲除小鼠，研究定向阻断祖细胞向两种发育路径上的HNF4a表达与肝-毛细胆管结构缺失以及成熟细胆管形成障碍的关系。本假说的验证对深入了解ACLF肝再生机制以及选择HNF4a作为该疾病治疗性靶点具有重要意义。

主要研究内容：.在动物水平，采用DDC饮食处理对小鼠肝细胞进行定向损害，进而观察AFP（+）HNF4a-/-小鼠肝-毛细胆管再生与未敲除HNF4a对照小鼠是否存在显著再生不良。.在患者水平，通过对收集的慢加急性肝衰竭（亚大块坏死病理特征）及肝硬化（无亚大块坏死）移植患者患肝组织进行基因表达分析，研究发生亚大块坏死肝组织是否存在紧密连接与转运泵表达的时空序列差异。..重要结果：.1..AFP（+）HNF4a-/-小鼠在DDC饮食喂养处理后，肝-毛细胆管结构仍旧可以形成，该发现与本研究最初提出的肝细胞选择性HNF4a-/-导致肝-毛细胆管无法形成的假说不符.2..对AFP（+）HNF4a-/-小鼠肝脏组织中mRNA表达显示形成肝-毛细胆管结构关键物理架构的紧密连接（TJs）和细胞粘附连接（AJs）的表达水平与对照组（HNF4a野生型）相比没有明显下降，表明肝-毛细胆管结构的物理架构形成不受HNF4a关键调控.3..我们在发生肝亚大块坏死的慢加急性肝衰竭移植患肝mRNA表达谱中比较了关于肝-毛细胆管结构中关于物理架构中关键蛋白TJs与AJs的表达以及反映转运功能的转运体（transporters）和细胞间隙连接(GJs) 相关蛋白的表达情况。发现再生不良患肝HNF4a明显下降的同时，参与肝-毛细胆管结构转运功能的ABCB11和GJB1、GJB2表达较对照组（非ACLF患肝）明显下降，但形成物理架构的TJs和AJs没有明显变化.4..我们进一步研究发现， 转运功能蛋白ABCB11和GJB1、GJB2上游直接或间接受到FXR/SHP复合体的调控。在慢加急肝衰竭再生预后不良患者，FXR的表达明显降低。.科学意义：.1..我们通过研究阐述了肝细胞再生轴中“肝-毛细胆管”分为两个阶段：早期紧密连接（TJs）和细胞粘附连接（AJs）为特征的物理架构形成阶段以及后续具转运功能的Transporters和GJB表达的功能形成阶段。.2..ACLF患者以及肝细胞受损伤的小鼠，再生轴中“肝-毛细胆管”物理形态的再生未出现障碍，但转运功能蛋白表达明显下降，表明“肝-毛细胆管”的功能再生障碍是肝细胞轴再生瓶颈。.3..HNF4a可能参与了其功能阶段的形成。同时本研究发现另一个转录调控因子FXR具有更直接调控功能转运蛋白的作用