从IncX3质粒的生物学特性探讨blaNDM-1在我国传播的广泛性和持续性

New Delhi metallo-β-lactamase 1 (NDM-1) producing bacteria represent an increasing threat to public health and to the treatment of serious nosocomial infections. In China, the blaNDM-1 exists in a number of bacterial species and it is strongly associated with the IncX3 plasmid. In the proposed studies here, we will investigate the mechanism behind the prevalence of the blaNDM-1 gene. A serious of experiments，including conjugation efficiency analysis, plasmid stability analysis, and gene expression analysis, will be employed to learn both the stability and the host range of pNDM-HN380 plasmid. Furthermore, the effect of hns gene (encoding an H-NS-like protein) on the stability and the host fitness of pNDM-HN380 will be determined by constructing a mutant plasmid lacking the hns gene (pNDM-HN380Δhns), and subsequently, the roles of hns gene in regulating the host genes expression under certain circumstances such as temperature, antibiotics pressure will be evaluated. There is a high probability of this project yielding novel insight into the prevalence of blaNDM-1 gene in China.

NDM-1肠杆菌目前在我国呈增长趋势。针对blaNDM-1多以IncX3型质粒为载体的生物学现象，本研究拟以前期实验中获得的携blaNDM-1质粒pNDM-HN380为研究对象，以IncX3型质粒生物学理论为基础，运用质粒接合、传代、以及质粒对宿主菌基因表达、生长和适应性影响等实验，研究该质粒长期稳定存在和在多种宿主菌中传播的特性。重点以质粒骨干区特有的H-NS样蛋白为研究对象，通过构建其缺失突变体pNDM-HN380Δhns，研究H-NS样蛋白对pNDM-HN380质粒稳定性、广泛传播性和宿主菌毒力等方面的影响，重点分析质粒H-NS样蛋白在细菌适应外界环境条件（温度、抗生素压力）中的所发挥的作用，从而探索我国pNDM-HN380质粒的进化、传播、及相应的分子机制，为控制blaNDM-1在我国的传播提供科学依据。

本项目基于blaNDM-1/IncX3质粒载荷大肠挨希菌在中国多地区散发分布，且存在时间跨度较长。提示质粒IncX3可能是引起blaNDM-1在中国广泛传播的主要载体。.按照计划书要求，完成了携带blaNDM-1的质粒的不相容群分析、质粒在不同肠杆菌中的可转移性、对大肠杆菌适应性代价和毒力影响，质粒和染色体敲除HNS基因的大肠杆菌工程菌株的构建和功能验证，并对亲代工程株和HNS基因敲除工程株进行转录组测序分析。.重要结果：.1）发现IncX3对大肠杆菌和沙门氏菌的接合率高于肺炎克雷伯杆菌、阴沟肠杆菌和奇异变形杆菌。.2）IncX3/J53接合子的无抗性环境下持续传代1000代后IncX3并未丢失，且blaNDM-1耐药基因也持续存在。接合菌的生长曲线与受体菌比较，无明显差异。.3）菌株竞争实验与生长曲线结果一致。与受体菌、野生菌株比较，IncX3/J53接合子在竞争实验中呈竞争性优势，IncX3/J53接合子的适应性代价指数<1。.4）蜡蛾毒力实验显示质粒IncX3载荷后并未增加菌株毒力，但在100代的传代后，IncX3/J53接合子毒力降低较明显。.5）分别构建了质粒HNS基因敲除体（J330/PΔHNS::Cm）和质粒与菌株染色体HNS基因双敲除体（J330ΔHNS/PΔHNS::Cm）。发现J330/PΔHNS::Cm与未敲除菌株比较，生长曲线在不同温度下（16℃,25℃,37℃）无明显差异；与J330/PΔHNS::Cm和原接合子相比， J330ΔHNS/PΔHNS::Cm在16℃时生长速度变缓，而25℃,37℃生长未受影响。.6）蜡蛾毒力实验结果提示，与亲代株相比，J330/PΔHNS::Cm和J330ΔHNS/PΔHNS::Cm HNS的毒力无明显差异。.7）E.coli J53、接合子J330及J330ΔHNS/PΔHNS::Cm进行转录组测序分析，发现主要差异基因存在于移动原件上，提示三株菌株间的细胞生长和凋亡、耐药基因和致病力之间的基因差异较少，也证实了前期实验结果的生长曲线以及耐药性的维持、致病力的一致性。对于接合子及双敲除菌的转录组学分析中发现，hns基因可通过上调质粒及宿主菌上的相关基因，促进质粒在宿主菌中稳定存并促进细菌在不利环境中的生存，有利于含质粒的细菌的生长及播散。该研究结果为了解blaNDM-1/IncX3质粒稳定性研究引导性作用。