基于blaCTX-M-15质粒数据库探讨NDM-1在我国传播的可能性

To evaluate the possibility of dissemination of the NDM-1-encoding gene (blaNDM-1) in enterobacter strains based on CTX-M-15-encoding epidemic plasmid databases. The information of resistance and the backbone area in plasmid were studied with reverse line blot assay (RLB), gene cloning and shotgun method, and identification of plasmids by PCR-based replicon typing. To construct the plasmid multilocus sequence typing (pMLST) method and learn the complete sequence of IncFII,IncA/C and IncL/M type plasmid habouring blaCTX-M-15,respectively. To learn genetic relationship between the plasmid habouring blaCTX-M-15 and the plasmid habouring blaNDM-1 published in PUBMED. Fitness cost of plasmid carriage was performed with competition test to count growth rates of blaCTX-M-15 or/and blaNDM-1 transformant of E.coli.

以本实验室分离携blaNDM-1的阴沟肠杆菌QT11的质粒为切入点，运用酶切克隆和鸟枪法获得质粒耐药区和骨干区序列信息。利用前期获得临床分离菌携blaCTX-M-15质粒，分析其不相容群，并针对IncFII、IncA/C和IncL/M型，利用反向线性杂交方法，分析质粒的耐药区基因结构；利用genebank已有这3个不相容群质粒全序列数据库，设计特异引物，筛选质粒骨干区看家基因，构建质粒MLST方法，了解blaCTX-M-15质粒间内在联系，构建blaCTX-M-15质粒数据库。将blaCTX-M-15数据库与QT11质粒及其它公布携blaNDM-1质粒全序列进行比较，了解两者间的遗传背景关系。根据质粒不相容群原理，将携blaCTX-M-15的IncFII质粒与携blaNDM-1的IncA/C质粒导入工程菌DH5a,研究质粒在宿主菌中的适应性代价。预测blaNDM-1在肠杆菌中传播的可能性.

本项目是基于4年前我国出现对碳青霉烯耐药的金属酶NDM-1，根据国外相关报道，利用质粒生物学理论，预测我国NDM-1未来的发生和流行趋势。按照计划书要求，完成了我国CTX-M型ESBL和NDM-1型碳青霉烯水解酶的分子流行病学及传播机制研究。发现CTX-M-14一直是我国最常见的ESBL，而可水解头孢他定的CTX-M-15在近年正演变为其变异体CTX-M-55，成为仅次于CTX-M-14的常见ESBL. IncFII质粒PC15-K（genebank ID: HQ202266）是介导CTX-M-15传播的主要载体，而IncI1/ST16和质粒IncF/F18:A-:B1共同介导了CTX-M-55在我国多省市的传播。NDM-1型碳青霉烯水解酶基因主要通过质粒IncX3传播。与申报计划不同的是, blaNDM-1并未携带CTX-M-15或CTX-M-55基因，也未发现IncX3质粒与携blaCTX-M-15或CTX-M-55的质粒共存菌株。结合试验与竞争性试验发现,双质粒转化C600的频率明显低于单质粒；但转化成功的双质粒接合菌C1527+J330和单质粒的接合菌C1527和J330均表现出适应性优势，尤其是C1527+J330表现更为突出，似乎更有利于质粒的广泛传播。但蜡蛾试验发现两个质粒接合菌的毒力低于单质粒接合菌。.结合IncX3和IncF质粒多见于食源性动物株的特点，本研究认为我国blaNDM-1可借助质粒在肠杆菌（尤其是大肠埃细菌）传播，但与bla CTX-M的传播并无直接相关性，由于菌株携带blaNDM-1质粒后的毒力水平下降，并未形成优势感染株，但因质粒对菌株并未出现适度性代价，使菌株在环境中易于存在。这个结论可基本解释我国目前blaNDM-1临床感染分离株一直存散发状态，未形成大规模流行的流行病学现状。