不同种系发育群大肠埃希菌与IncX3型耐药质粒共进化的比较性分析

Based on previous conclusion that Escherichia coli isolates carrying blaNDM-1-harboring IncX3 plasmid sporadically spread in China, this study is to explore the parallel compensatory evolution of the different phylogenetic groups of Escherichia coli with Incx3 plasmid. Clinical isolates of E.coli carrying blaNDM-1-IncX3 plasmid were screened and classified by phylogenetic type, serum and ST type. Cost fitness and conjugation rate were estimated for the reference plasmid pNDM-HN380 transformants of phylogenetic types with clinical significance. After serial passages under selective pressure, Comparative Genomic analysis of both different transformants and their parent were performed to obtain key SNPs of genes encoding global regulation system, and to learn the molecular mechanism of stabilizing plasmids under different pressure. Furthermore, the transcription level of key genes associated with plasmid stabilization was determined by transcriptomic analysis of the difference strains. The molecular mechanism of the dynamics and mechanisms of bacteria-plasmid adaptation will thereby be preliminarily identified, and the predominant clones carrying IncX3 plasmid could be further predicted.

本课题在前期获得的“blaNDM-1在我国主要以IncX3质粒在大肠埃希菌进行散发性传播”的研究结论基础上，进一步探寻IncX3质粒与大肠埃希菌的共进化机制。以前期携blaNDM-1/IncX3大肠埃希菌临床株为对象，通过分析菌株的种系发育群、血清型和ST型，获得不同遗传标志代表株; 将已知基因序列的参考质粒blaNDM-1/IncX3转化到与临床株遗传标志匹配的大肠埃希菌工程株，比较转化率和转化株适应性代价的差异。在不同抗性压力下对转化株与前期获得的携blaNDM-1/IncX3临床株传代，比较转化工程株及相应的传代株的基因组，重点甄别全局性调控系统基因的关键突变点,继而分析其影响质粒稳定的机制；通过转录组分析目标突变株的基因调控差异，对转录水平存在显著差异的关键基因进行解析与验证。最终初步明确IncX3与大肠埃希菌共进化的分子机制，并预测未来可能流行的携IncX3大肠埃希菌种系。

本项目基于blaNDM-1在我国主要以IncX3质粒在大肠杆菌进行散发性传播，提示blaNDM-1/IncX3耐药质粒与大肠杆菌存在特定的内在关系。.按照计划书要求，检测了携带blaNDM-1的IncX3质粒在大肠杆菌不同种系发育群中的可转移性和稳定性情况，对有抗性无抗性环境下传代后仍保留blaNDM-1/IncX3的菌株进行了适应性代价分析，且进行了横纵向的组学分析。对近十年我国分离的IncX3质粒进行比较基因组学分析，以解析其进化特征与遗传基础。.重要结果：.1）对120株大肠杆菌进行质粒接合实验，接合成功率19.17%。将所有接合子在有/无抗性环境下传代，26.07%（6/23）的接合子可稳定传代300代至500代（工程株2株，临床株4株）。对4株可稳定传代的临床株进行系统发育群和ST型分析，发现主要为系统发育群C群和D群，ST型为ST167、ST69、ST405。.2）2株工程株在有/无抗性环境下，均随着传代代数增加，适应性代价减少。系统发育群D群ST405、ST69的临床株中，初代接合子和有/无抗性下传代后的子代菌株均表现出适应性优势。系统发育群C群ST167的菌株中，随着传代代数增加，适应性代价增加。 .3）将所有可稳定传代的野生株、初代接合子及其不同环境传代后子代菌株的基因组学进行配对分析，发现共有40个基因存在单核苷酸多态性（SNP）突变位点，不同的菌株snp各不相同。突变基因的功能主要与细菌代谢相关，只有1个突变基因与质粒转移频率相关。提示细菌染色体上发生的突变补偿不是blaNDM-1/IncX3质粒在大肠杆菌中稳定存在的原因。.4）对已发表的近10年分离自中国的IncX3质粒全基因序列进行基因组学分析。IncX3质粒由基础骨架区和基因负载区组成，质粒骨架区高度保守，骨架区的基因组成使质粒本身具备介导blaNDM持续传播的能力，携带NDM耐药基因的基因负载区呈现多变的特点。质粒骨架区高度保守，提示质粒不需要通过突变补偿来维持质粒在菌株中的稳定。.5）DH5α的转录组学分析发现获得质粒造成宿主452个染色体基因的转录水平改变：253个基因上调，199个基因下调。40%的差异表达基因与代谢有关,与基因组突变分析结构吻合。差异表达基因主要集中在精氨酸、谷氨酰胺代谢通路上，进一步提示质粒进入细菌后，氨基酸代谢引起的非突变补偿可能为质粒稳定存在的原因之一。