非编码小RNA引发mRNA 3'端脱腺苷酸化的机制

哺乳动物编码几百种miRNA，参与调控超过三分之一基因的表达，并与多种疾病存在重要关联。miRNA不仅能抑制靶基因的翻译，还可以引起mRNA降解。我前期的研究发现miRNA通过加速靶标mRNA 3'端poly(A)的脱腺苷酸化导致整个mRNA被迅速降解，其中脱腺苷酸化是mRNA降解过程的关键和限速步骤。最近我们发现RNA干扰中的off-target现象也与mRNA的脱腺苷酸化作用有密切关系。因此研究哺乳动物中miRNA和siRNA导致mRNA加速脱腺苷酸化的机制具有重要的理论意义和应用价值。我们将运用生物化学和分子生物学手段，分离鉴定miRNA和siRNA引发的mRNA加速脱腺苷酸化过程中的关键酶，分析其生化活性，研究受该酶调控的mRNA的种类与功能，揭示该酶在小RNA引起mRNA降解过程中的作用原理及其调控机制，为深入理解小RNA的功能和提高RNA干扰的专一性提供理论依据。

MicroRNA（miRNA）是真核生物基因组所编码的一种小分子RNA，参与调控超过三分之一基因的表达。miRNA不仅能抑制基因的翻译，还可以通过加速mRNA 3’端poly(A)的脱腺苷酸化导致整个mRNA的快速降解。其中3’端poly(A)的脱腺苷酸化是mRNA降解过程的第一步和限速步骤。我们在前期工作基础上，通过竞争抑制和RNA干扰（RNAi）等一系列方法，发现CCR4-NOT复合体的成员，CAF1和POP2在miRNA引起的mRNA脱腺苷酸化和降解过程中发挥了关键作用，而CCR4a和CCR4b也有一些贡献。我们还通过实验证明RNAi的off-target（脱靶效应）是siRNA以类似于miRNA的机制，通过加速mRNA的脱腺苷酸化而导致与siRNA存在部分互补配对序列的mRNA被快速降解，并且这个过程也依赖于CAF1和POP2。miRNA和siRNA对基因表达的调节作用依赖于与之结合的蛋白质分子。通过Tethering的方法，我们发现人类编码的四种Ago蛋白都能加速mRNA的脱腺苷酸化。但是CCR4-NOT复合体与RISC主要成员Ago和GW182间并不存在稳定的相互作用，亚细胞共定位实验也表明CAF1和POP2并不与Ago和GW182蛋白共定位于P小体（P-body）中。基于以上结果我们认为RISC并不是通过招募CAF1和POP2而发挥功能，而可能通过与mRNA结合后，造成mRNP结构和功能的改变，从而促进核酸酶对mRNA的降解作用。我们通过实时定量RT-PCR的方法检测了小鼠组织中CAF1和POP2的表达情况，发现大多数组织中CAF1的表达水平明显高于POP2，在大脑、小脑以及睾丸组织中表达量特别高，用RNAi沉默CAF1表达后细胞生长受到明显抑制。在进化中CAF1和POP2在酵母、线虫、果蝇和海鞘中都只存在单一基因，而进化到鱼类后才产生了CAF1和POP2同源基因。结合实验和进化分析，我们认为真核生物是在miRNA出现后进化产生了CAF1和POP2两个同源基因，两者具有一定程度的功能冗余。在脊椎动物体中CAF1主要负责miRNA引起的mRNA脱腺苷酸化，而POP2可能在特定细胞和发育阶段担负调控功能，比如在胚胎早期发育中的中囊胚转化（MTZ）过程中介导miRNA对母源mRNA的降解。