非编码小RNA在受精卵发育中的降解和功能调控机制

During fertilization to early zygotic development,cells undergo a switch from a singular function to a totipotent cell which involves massive molecular rewriting.Small non-coding RNAs play important roles in diverse cellular processes,but little is known about their function and expression dynamics during early embryonic development of mammalians.We investigated the expression profiles of small RNAs in mouse mature sperm,metaphase II oocytes and early zygotic embryos(1- to 8-cell stages) using the ultrasensitive small RNA library construction method for deep sequencing developed in-house.This data established a small non-coding RNA expression profile of the very early stages of mouse embryo development,yielding a novel and valuable resource for studies in developmental research.Significant sequence variation was observed at the 3’ends of miRNAs and endo-siRNAs,with the multiple extra adenosines added at the 3’end in a non-template directed manner,which is not exist in the somatic cells.Interestingly,this 3’non-template A adding is correlated with the rapid degradation of maternal miRNA in 1- and 2-cell stages,which indicate a possible mechanism in miRNA stability control in these cells.Targets prediction also showed a significant down-regulating effect of maternal mRNAs by miRNA in 4-cell to 8-cell stages,but not oocyte to 2-cell stage,indicating miRNAs’ function were suppressed in oocyte to 2-cell stage and reactivated in 4-cell stages.We also identified a large set of endo-siRNAs and piRNAs mainly from repetitive elements,which were potentially necessary for developmental progression and need to be further investigated.

非编码小RNA在受精卵和胚胎早期发育中具有非常重要的功能，但目前对哺乳动物受精卵分裂和早期发育中的非编码小RNA的加工、修饰、降解和功能调控的规律知之甚少。在本申请中，我们将利用新建立的微量小RNA深度测序方法，结合生物信息学、分子生物学和细胞生物学的方法，寻找新的非编码小RNA，并对其产生途径进行预测和分析；研究小鼠卵子和受精卵早期发育中miRNA和endo-siRNA 3’末端加A和U的规律，及其与miRNA和endo-siRNA稳定性和降解调控之间的关系；研究miRNA对靶基因mRNA的降解功能在受精卵1-细胞和2-细胞中被抑制，而在4-细胞期被重新激活现象的分子机制。我们将通过上述研究揭示哺乳动物受精卵早期发育中miRNA和endo-siRNA 3’末端加A修饰与miRNA稳定性的调控机制，以及miRNA沉默靶基因的功能被抑制和重新激活的调控机制。

非编码小RNA在受精卵和胚胎早期发育中具有非常重要的功能，但目前对哺乳动物受精卵分裂和早期发育中的非编码小RNA的加工、修饰、降解和功能调控的规律知之甚少。目前小RNA深度测序的文库构建通常要几百纳克（ng）总RNA，难以对配子和胚胎等难以大量获取的生物学样品中的小RNA表达谱进行研究。我们通过优化基于连接反应的小RNA文库构建方法，使得总RNA用量降低了几十倍，仅需要10纳克总RNA即可在Illumina测序仪上实现对小RNA的深度测序，为研究配子、胚胎和各种干细胞中的小RNA提供了重要技术支撑。我们利用优化的小RNA深度测序方法系统解析了小鼠卵子到受精后8细胞胚胎发育过程中的小RNA动态变化，发现小鼠卵子和早期胚胎主要包含三类小RNA：endo-siRNA、piRNA和miRNA。受精卵中的这三类小RNA绝大多数来源于卵子，由精子带入卵子的小RNA不足几百分之一。随着胚胎的发育，母源endo-siRNA和piRNA逐渐被缓慢降解。而母源miRNA的降解较快，主要发生在胚胎2细胞期前后，其中有近20%的miRNA 3’末端被加上了一个或四个腺苷酸（A），其降解速率与未被腺苷酸化的miRNA相比明显减缓，推测可能3’末端腺苷酸化发挥了保护作用，使某些miRNA免于在母型至合子型转化中被快速清除。合子中新表达的miRNA最早出现在受精卵第一次分裂前，并随着胚胎的发育持续被激活表达，特别是进化保守的miRNA的表达量迅速上升。我们进一步结合小鼠早期胚胎发育的转录组数据进行分析，发现miRNA在卵子到胚胎2细胞期中几乎没有降解靶基因mRNA的功能，而在4-8细胞期中miRNA降解靶基因mRNA的功能开始逐步恢复，并对合子激活表达的基因有明显的靶向抑制作用。以上研究不仅揭示了小鼠早期胚胎发育中miRNA的表达和降解规律，还发现了miRNA对靶基因的调控活性随着胚胎发育而被动态调控的现象。该研究优化建立了适用于微量样本的小RNA深度测序文库构建方法，并系统解析了小鼠早期胚胎发育过程中小RNA的动态变化及其生物学功能，对于理解miRNA在早期胚胎发育中的功能和机制具有重要意义。